PDT02是一种通过噬菌体展示技术及后续氨基酸优化鉴定出的肽段，采用固相肽合成法制备，并用镓-68进行放射性标记，从而获得用于尿激酶型纤溶酶原激活物受体（uPAR）成像的68Ga-PDT02。该化合物具有较高的放射化学纯度，且对uPAR表现出中等结合亲和力（KD = 531.3 nM）。体外实验显示，在uPAR阳性MKN45-huPAR细胞中的摄取量显著高于A549细胞，表明存在受体介导的结合。在携带MKN45-huPAR异种移植瘤的小鼠体内进行PET成像时，观察到肿瘤组织特异性蓄积：注射后30分钟平均摄取量达2.88% ID/mL，随后从非靶组织快速清除。生物分布研究证实其可快速经肾脏排泄且在血液中滞留率低，从而实现优异的肿瘤与背景对比度。综上所述，这些结果表明68Ga-PDT02是一种具有理想药代动力学特性及成像性能的uPAR靶向PET示踪剂，为无创可视化检测侵袭性肿瘤中uPAR表达提供了有力支持。

生物层干涉测量法（BLI）测定了PDT02的解离常数（KD），并实验性评估了其与uPAR的结合亲和力。PDT02的解离常数为531.3 nM（图3C），证实该肽段对uPAR具有中等结合亲和力。

尽管uPAR在癌症细胞中通常过度表达，但其表达水平因不同细胞系而异。为阐明这些表达差异对探针摄取的影响，作者通过蛋白质印迹（WB）分析定量检测了多种细胞系中的uPAR表达水平，并采用细胞摄取实验评估探针特异性（图4A、B）。WB结果显示：MKN45−huPAR、HT−1080和PC−3细胞中的uPAR表达量分别比A549细胞高11.41倍、13.70倍和9.30倍，且差异具有统计学意义（图4C、S20及表S4-S5）。据此，MKN45−huPAR被归类为uPAR高表达细胞系，而A549则归类为uPAR低表达细胞系。基于WB分析中观察到的极低uPAR表达水平，A549细胞被选作uPAR低表达对照组，适用于评估受体特异性摄取能力。细胞摄取实验表明，PDT02在uPAR高表达细胞系（MKN45−huPAR）中的摄取量显著高于uPAR低表达细胞系（A549）（图4D及表S6）。值得注意的是，在孵育后30分钟和60分钟时，MKN45−huPAR细胞的摄取量分别比A549细胞高8.06倍和16.81倍（图4E及表S7）。

在通过细胞实验验证后，作者进一步在多种表达uPAR的异种移植肿瘤模型中开展PET成像研究，以评估68Ga-PDT02的体内肿瘤靶向能力及显像对比度。首先在携带MKN45-huPAR肿瘤的裸鼠模型中初步评估了68Ga-PDT02的体内肿瘤靶向特性（图5A）；随后在HT1080（uPAR高表达）异种移植模型中全面评估了该药物的肿瘤蓄积情况及后续显像性能（图5C）。

结果显示：PDT02在MKN45-huPAR异种移植瘤中的平均肿瘤摄取率在给药后30分钟和60分钟分别为2.88%ID/mL和1.77%ID/mL。分别采用注射给药方式（图5A、D，表S8）。PET/CT图像进一步显示，68Ga-PDT02在不同体积的肿瘤组织中均表现出显著的摄取（图5D及表S8）。在HT1080异种移植模型中，注射后30分钟时平均摄取值为1.72% ID/mL（图5C）。68Ga-PDT02还呈现以肾脏为主的清除途径，在正常组织中的摄取量极低；根据%ID/mL值计算，其肿瘤与器官间的摄取比值表现优异（图5E、H）。在阻断组中，预先注射250 μg非放射性标记的PDT02可显著降低肿瘤内的平均积聚量（注射后30分钟和60分钟分别为0.70% ID/mL和0.45% ID/mL），证实了该探针具有明确的靶向特异性（图5B及表S8）。

作者进一步在MKN45−huPAR异种移植模型中评估了68Ga−AE105的肿瘤蓄积特性及影像学表现。PET/CT成像结果显示，68Ga−AE105具有显著的显像活性。68Ga-PDT02在肿瘤组织和非靶组织中均表现出相对较高的摄取率（图S21），而其肿瘤选择性显著优于其他探针；此外，该探针主要通过肾脏清除，非靶器官中的滞留量极低，从而获得理想的肿瘤与器官比值（图S21）。这些结果共同表明，68Ga-PDT02是用于uPAR阳性肿瘤成像的极具潜力的PET探针候选物。

接下来，作者在MKN45−huPAR异种移植模型中开展的体外生物分布研究进一步评估了68Ga-PDT02的肿瘤靶向特异性及体内分布情况（图6A）。分别在注射后30分钟和60分钟采集组织样本，肿瘤摄取值分别为4.92 ± 0.77 and 2.09 ± 0.74%ID/g（表S9）。68Ga-PDT02从血液中快速清除（60分钟时为2.68 ± 0.68%ID/g at 30 min and 1.00 ± 0.34%ID/g），其他非靶器官也呈现类似的快速清除趋势。针对心脏、肝脏、脾脏、肺、肌肉、血液和大脑计算的肿瘤与各器官比值均显示，在所有时间点肿瘤与肾脏的比值均较高（图6B-I及表S9）。

这些结果表明，68Ga-PDT02快速的肾脏清除特性可降低肾脏代谢负担，充分体现了其优异的药代动力学特性及在uPAR靶向分子成像中的应用潜力。

在小鼠和大鼠中均评估了PDT02的急性及长期毒性。急性毒性通过单次尾静脉注射PDT02（2.0 mg/kg，100 μL）进行评估，并以生理盐水处理的动物作为对照组。对主要血液学参数（包括白细胞（WBCs）、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞百分比、单核细胞百分比、淋巴细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比、红细胞（RBCs）及血红蛋白（Hb））的定量分析显示无显著差异。在PDT02组与对照组之间（图7A、S22A及表S10–S11）。

在单次静脉注射PDT02（2.0 mg/kg，100 μL）10天后评估了其长期毒性。对主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和大脑）的H&E染色切片进行组织病理学检查显示，与相应的生理盐水对照组相比，未发现明显的病理改变或组织损伤（图7D和图S22D）。为进一步评估全身安全性，对肝功能（ALT、AST、ALB、ALP、 γ -GT）和肾功能（BUN、CR、UA）的血清生化标志物进行了定量分析。统计学分析表明，PDT02治疗组与对照组之间无显著差异（图7B、图S22B及表S12-S13）；各组间体重亦无显著差异（图7C、图S22C及表S14-S15）。

综上所述，这些结果表明在测试条件下，PDT02不会引起肝毒性、肾毒性或明显的组织学异常。

参考文献：doi.org/10.1021/acs.jmedchem.6c00872