中等大小的环肽是小分子化合物和大分子生物制剂之外的一类药物。CD47-SIRPα 信号轴作为先天免疫检查点，可抑制吞噬细胞的吞噬作用，已被认为是癌症免疫治疗的一个有前景的靶点。然而，针对该信号轴的环肽作为免疫治疗剂的潜力尚不清楚。在此，文章开发了一种由 15 个氨基酸组成的环肽，它能与小鼠 SIRPα 的胞外域结合，并以别构方式有效阻断其与 CD47 的相互作用。该肽在体外显著促进了巨噬细胞对抗体包被的肿瘤细胞的吞噬作用，并在体内增强了抗 CD20 或抗 gp75 抗体对肿瘤形成或转移的抑制作用。文章的结果表明，通过环肽别构抑制 CD47-SIRPα 相互作用是癌症免疫治疗的一种潜在方法。

名称：D4-2

字母 H2N-RYSAVYSIHPSW-OH酰胺键成环

多字母 c(Arg-Tyr-Ser-Ala-Val-Tyr-Ser-Ile-His-Pro-Ser-Trp)

氨基酸个数 12

分子式 C69H94N18O17

平均分子量(MW) 1447.62

借助随机非标准肽整合发现（RaPID）系统，文章现已开发出能与小鼠 SIRPα 的 Ig-V 样结构域结合从而阻断 CD47-SIRPα 相互作用的大环肽。RaPID 系统依靠柔性酶辅助的遗传密码重编程与 mRNA 展示相结合，生成包含超过 1×10^12 个独特成员的大环肽库，并从中筛选出对目标蛋白具有高亲和力和选择性的肽。此外，为了阐明此类大环肽抑制 CD47-SIRPα 相互作用的机制，文章确定了 SIRPα-肽复合物的晶体结构。最后，文章研究了大环肽与抗肿瘤抗体（如针对 CD20 或 gp75 的抗体）的组合是否能促进体外巨噬细胞介导的肿瘤细胞吞噬作用，以及是否能减轻人异种移植或小鼠同基因肿瘤模型中的肿瘤生长和转移。

文章已鉴定出由 15 至 17 个氨基酸组成的环肽，它们对小鼠 SIRPα 的 Ig-V 样结构域具有类似抗体的亲和力。这些肽包含 R(F/Y)(S/T)(A/P)V 序列基序，与小鼠 SIRPα 的结合常数（KD 值）处于低纳摩尔范围（约 10 至 60 纳摩尔），并且在体外能阻断 CD47-SIRPα 之间的相互作用。肽 D4-2 还显著增强了体外巨噬细胞对抗体包被的肿瘤细胞的吞噬作用，并在人异种移植或小鼠同基因肿瘤模型中增强了针对肿瘤抗原（包括利妥昔单抗和 TA-99）的单克隆抗体的抗肿瘤效果。在免疫功能正常的鼠中，用 D4-2 进行治疗对血液学和血液生化参数没有不良影响，仅血尿素氮和总胆固醇水平略有下降。因此，文章的结果表明，与 SIRPα 结合的环肽是针对癌症免疫治疗中 CD47-SIRPα 信号传导的潜在治疗剂。

文章发现 D4-2 以别构方式抑制 CD47-SIRPα 相互作用。实际上，D4-2 降低了 CD47 对 NOD SIRPα 的亲和力以及 CD47 与 NOD SIRPα 的最大结合量，这表明其抑制模式是非竞争性的，而非竞争性抑制。此外，X 射线晶体学显示，IgV-NOD SIRPα 与 D4-2 的结合位点位于包含 C'E 和 EF 环以及 C' 和 E 链的表面区域。鉴于此前已证实人 SIRPαv2 的 Ig-V 样结构域与人 CD47 在由 BC、FG、C'D 和 DE 环围成的凹槽处接触，而该凹槽与 IgV-NOD SIRPα 的 BC、FG 和 C'E 环围成的凹槽相对应（图 S7），所以该结合位点不太可能与 CD47 的结合界面重叠。文章还发现，IgV-NOD SIRPα 与 D4-2 复合物中 C' 和 E 链之间的区域构象与先前确定的小鼠 SIRPα 的 Ig-V 样结构域（PDB：2YZ1）（图 3F）以及人 SIRPαv2 的 Ig-V 样结构域与人 CD47 结合的结构（PDB：（图 S7）中，IgV-NOD SIRPα 通过直接氢键、盐桥和疏水相互作用与 D4-2 接触。该区域已被证实包含对 SIRPα 与 CD47 直接接触至关重要的氨基酸残基。因此，D4-2 可能通过改变 CD47 结合界面的构象来调节小鼠 SIRPα 与 CD47 的结合亲和力，从而导致 CD47-SIRPα 相互作用的别构抑制，这种机制不同于阻断 CD47 结合界面的抗 SIRPα 抗体所确定的机制（正构抑制）。

与正构配体相比，别构调节剂作为治疗剂具有更高的选择性和更少的不良反应等若干优势。大多数阻断 CD47-SIRPα 相互作用的抗 SIRPα 抗体由于其 Ig-V 样结构域的高序列相似性，已被发现会与 SIRP 家族的其他成员（SIRPβ 或 SIRPγ）发生交叉反应，这表明这些抗体可能会影响其他 SIRP 家族成员的功能。相比之下，大环肽 D4-2 与 B6 SIRPα 和 NOD SIRPα 的结合亲和力很高，但与小鼠 SIRPβ 和人 SIRPαv2 的交叉反应性很小。在介导与 D4-2 在界面直接接触的 14 个 NOD SIRPα 氨基酸中（图 S5；表 S2），分别有 12 个和 9 个残基在小鼠 SIRPβ 和人 SIRPαv2 中是保守的（图 S3A）。因此，D4-2 对小鼠 SIRPα 具有高度选择性。此外，鉴于文章仅通过四轮筛选就分离出了 D4-2，RaPID 方法确实是一种高通量筛选系统，能够识别出与目标蛋白特异性结合的别构调节剂，即使这些目标蛋白具有高度相似的家族成员。借助 RaPID 系统，文章还发现了一种大环肽，它对人类的 plexin B1 具有专一性，而对其他人类和小鼠的 plexin 类型则无此特性。

抗 SIRPα 抗体对 SIRPα 的阻断已被证实能增强巨噬细胞和中性粒细胞对肿瘤细胞的抗体依赖性杀伤作用。在体内实验中，抑制 CD47-SIRPα 相互作用的抗 SIRPα 单克隆抗体（mAbs）也被发现能促进抗肿瘤抗原抗体（如利妥昔单抗）对肿瘤生长的抑制作用。在肿瘤模型中，巨噬细胞或中性粒细胞的耗竭显著削弱了这种联合疗法的效果，这表明这些先天免疫细胞确实是抗肿瘤作用的关键效应细胞。与抗 SIRPα 单克隆抗体的作用一致，D4-2 抑制了小鼠 SIRPα 与 CD47 的结合，并在体外增强了巨噬细胞介导的肿瘤细胞 ADCP（抗体依赖性细胞吞噬作用），同时在体内增强了肿瘤靶向抗体对肿瘤生长和转移的抑制作用。单独使用 D4-2 对 Raji 细胞或 B16BL6 细胞（其细胞表面高表达 SIRPα）的巨噬细胞吞噬作用以及 B16BL6 细胞的生长、活力、迁移和形态几乎没有影响。与抗 SIRPα 抗体与肿瘤靶向抗体联合使用时的抗肿瘤作用类似，D4-2 在体内的抗肿瘤作用至少部分可能是由于促进了巨噬细胞介导的肿瘤细胞 ADCP。然而，仍需进一步研究以阐明靶向 SIRPα 的大环肽抗肿瘤作用的确切机制。

总之，通过使用 RaPID 系统，文章已鉴定出能特异性结合 SIRPα 并阻断 CD47-SIRPα 相互作用的大环肽。此外，文章还表明，此类肽可能是用于癌症免疫治疗的有效工具，且不会产生严重不良反应。鉴于 CD47-SIRPα 系统在自身免疫性疾病的发展以及中枢神经系统功能调节中也发挥着作用，靶向 SIRPα 的大环肽也可能成为治疗其他人类疾病（如自身免疫性疾病和神经系统疾病）的潜在药物。

参考文献：doi.org/10.1016/j.chembiol.2020.06.008