诺氏疟原虫是第五种可感染人类的疟原虫，已导致人类死亡。文章旨在通过针对裂殖子表面蛋白1蛋白19千道尔顿片段的随机线性十二肽噬菌体展示技术，来鉴定诺氏疟原虫的新结合肽。

rPkMSP-119蛋白通过Expresso®可溶性和表达筛选系统以及E.cloni®10G感受态细胞进行异源表达，操作依照相关方案进行。使用Ph.D.™-12随机噬菌体展示文库对纯化的rPkMSP-119进行了三轮生物淘选，以鉴定与rPkMSP-119结合的肽段。利用CABS-dock网络服务器对鉴定出的肽段与PkMSP-119的结合位点进行了计算机预测。

经过三轮生物淘选，鉴定出四种与PkMSP-119结合的噬菌体肽变体，即Pkd1、Pkd2、Pkd3和Pkd4。Pkd1和Pkd2的序列都包含大量的组氨酸残基。Pkd1与BSA对照相比，结合信号为6.1倍。对接结果表明，Pkd1和Pkd2是PkMSP-119的理想结合肽。

文章通过噬菌体展示技术鉴定出了两种新型的PkMSP-119结合肽，即Pkd1（HFPFHHHKLRAH）和Pkd2（HPMHMLHKRQHG）。它们为新型治疗药物的研发提供了宝贵的起点。

名称：Pkd1

单字母 H2N-HFPFHHHKLRAH-OH

多字母 H2N-His-Phe-Pro-Phe-His-His-His-Lys-Leu-Arg-Ala-His-OH

氨基酸个数 12

分子式 C74H102N26O13

平均分子量(MW) 1563.77

名称：Pkd2

单字母 H2N-HPMHMLHKRQHG-OH

多字母 H2N-His-Pro-Met-His-Met-Leu-His-Lys-Arg-Gln-His-Gly-OH

氨基酸个数 12

分子式 C64H101N25O14S2

平均分子量(MW) 1508.78

疟疾蛋白是利用体外方法最难表达的蛋白质之一，因为其基因密码子使用极为特殊。即便成功表达，重组蛋白通常也会错误折叠，形成包涵体。人们已对多种生物体用于生产疟疾蛋白进行了测试，包括大肠杆菌、毕赤酵母（酵母）、转基因小鼠和转基因烟草植物。其中，大肠杆菌是最常用的表达系统。然而，在大肠杆菌中表达的许多蛋白质质量并不理想。在很多情况下，重组蛋白会在细菌细胞内沉淀形成不溶性包涵体。疟原虫基因组中高A/T与C/G含量以及频繁出现的赖氨酸和精氨酸重复序列被认为是形成包涵体的主要原因。大多数疟原虫来源的重组蛋白倾向于聚集，从而在细菌细胞中形成不溶性包涵体。蛋白质的溶解性与其在翻译后折叠过程中形成的正确结构相关。如果蛋白质折叠错误，它们往往会以聚集体的形式在细菌细胞内积聚。细菌倾向于将这些聚集体储存在受限结构（包涵体）中，以避免对宿主系统产生毒性作用。在本研究中，pSlyD-PkMSP-119在大肠杆菌中成功表达，但以分子量约为40千道尔顿的不溶性物质形式沉积。这可能是由于疟原虫诺氏疟原虫（63%）富含A/T的基因组所致。随后，使用含尿素的缓冲液溶解包涵体，并通过醋酸纤维素膜过滤器过滤，然后进行重组蛋白纯化。

文章的研究存在若干局限性。首先，筛选过程是使用线性蛋白进行的；未对蛋白进行复性。其次，未进行诸如使用诺氏疟原虫培养物的裂殖子抑制试验等功能性检测，未来的研究应考虑进行此类检测，因为这将为这些肽抑制裂殖子入侵的能力提供更具说服力的结果。不过，这仍是首次鉴定出诺氏疟原虫 MSP-119 结合肽的研究之一。

除了噬菌体展示技术外，三维结构构建和/或蛋白质对接技术极大地提高了肽结合相互作用研究的准确性和速度。计算对接方法已被证明在预测蛋白质 - 肽相互作用方面很有用，并有助于识别肽结合位点。例如，从噬菌体展示文库中筛选出的 rPvAMA-1 潜在结合肽已被定位到蛋白质外质区的位置，并且结合位点已通过使用 CABS-dock 成功预测。在文章的研究中，通过使用 CABS-dock 网络服务器对噬菌体展示筛选肽与 PkMSP-119 的结合位点进行了计算机预测。

总体而言，从生物淘选中鉴定出的三个结合肽显示出中等程度的共识序列基序，因为没有一个共识基序能在所有肽中都看到；但在序列中观察到了保守的氨基酸残基，即组氨酸、脯氨酸、赖氨酸和精氨酸。据推测，具有这四个残基的肽有可能与 PkMSP-119 结合。先前的研究报告称，即使噬菌体展示筛选出的肽缺乏共识基序，对接模拟也有助于高效地找到高亲和力肽。因此，对四个结合肽，即 Pkd1、Pkd2、Pkd3 和 Pkd4 进行了对接预测。然而，Pkd3 和 Pkd4 并非 PkMSP-119 的理想结合肽，因为原子位置的平均均方根偏差（平均 RMSD）值高于 RMSD 的截止值（3.5 Å）。计算机模拟预测显示，Pkd2 对 PkMSP-119 的结合亲和力似乎高于 Pkd1。Pkd2 对 PkMSP-119 的结合亲和力似乎更高，并形成更稳定的组合，这从其较低的 RMSD（1.78 - 2.13 Å）与 Pkd1（1.99 - 3.34 Å）相比可以看出。此外，预测到 Pkd2 的组氨酸残基（His1）会与 PkMSP-119 的色氨酸 34（Trp34）结合（表 4）。PkMSP-119 的 Trp34 是一个非常适合蛋白质间相互作用的位点，并且对组氨酸残基表现出很强的结合亲和力。肽段分析表明，所有四个结合肽段的序列都包含组氨酸残基，其中 Pkd1 含量最多，其次是 Pkd2、Pkd4 和 Pkd3。这并不令人意外，因为 Garman 等人揭示了 PkMSP-119 晶体结构的第 1 结构域存在组氨酸结合位点。该组氨酸结合位点位于第 1 结构域的中心，由一个色氨酸（Trp34）形成，该色氨酸在第 1 结构域上形成一个架子，能够结合组氨酸。此外，PkMSP-119 的晶体接触图表明，第 1 结构域中的色氨酸及其附近区域在参与蛋白质间相互作用方面非常活跃。根据 Garman 等人的研究，晶体接触分析揭示了七个残基——异亮氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、色氨酸、谷氨酸、丙氨酸和丝氨酸——可能参与蛋白质结合相互作用。

本研究中 CABS-dock 的结果表明，PkMSP-119 总共有 11 个氨基酸残基（即天冬氨酸、色氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、精氨酸和组氨酸）被预测为与 Pkd1 的结合位点。至于 Pkd2，仅观察到 10 个氨基酸残基，即天冬氨酸、亮氨酸、色氨酸、谷氨酸、丙氨酸、丝氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸（表 3 和表 4）。Pkd1 和 Pkd2 的预测结合氨基酸残基非常相似，PkMSP-119 上有 8 个共同的结合残基（即天冬氨酸、色氨酸、谷氨酸、丝氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸）是这两种肽的结合位点。其中 4 个（即天冬氨酸、色氨酸、谷氨酸和丝氨酸）与 Garman 等人的预测结果一致。PkMSP-119 的结构域 1 是一个结合热点，结构域 1 中的组氨酸结合位点是抑制剂（如阻断肽或抗体）结合 MSP-1 的靶点，这可能会阻止裂殖子侵入红细胞。

加曼等人 还证明了 PkMSP-119 的晶体结构与 P. cynomolgi 的晶体结构极为相似。据推测，本研究中鉴定出的结合肽可能对 P. cynomolgi 具有结合亲和力；然而，需要进一步的研究来检验这种相互作用。

与 PkMSP-119 具有高结合亲和力的肽有可能抑制裂殖子入侵，从而有助于发现基于合成肽的抗疟疾药物或疫苗。能特异性识别并能与 PkMSP-119 发生反应的肽也可能在开发用于检测这种寄生虫的血清学诊断试验中充当蛋白质探针。与 PkMSP-119 具有高结合亲和力的肽有可能抑制裂殖子入侵，这有助于发现基于合成肽的抗疟疾药物或疫苗。肽本身可能无法成为有效的药物，但或许可以对其进行修饰并用作药物递送化合物或蛋白质结合剂。此外，能特异性识别 PkMSP-119 的肽可能在开发用于检测 P. knowlesi 的诊断工具或快速检测试剂盒中充当蛋白质探针。

总之，文章通过噬菌体展示技术成功地鉴定了两种新型的 PkMSP-119 结合肽：Pkd1（HFPFHHHKLRAH）和 Pkd2（HPMHMLHKRQHG）。进一步的研究需要评估它们在抗疟疾药物、疫苗或诊断工具开发中的潜在益处和局限性。还需要对每种肽在分子相互作用和功能方面进行深入的研究和表征。