淋巴结是肿瘤细胞最常见的转移部位，与患者预后密切相关。据报道，癌细胞可以上调CC趋化因子受体7(CCR7)的表达并劫持其正常功能，使其能够沿着CCL19和CCL21的梯度向淋巴结和淋巴集落迁移，作为远处转移的初始阶段。通过对TCGA和GEO数据库的分析，肿瘤患者淋巴结中的转移性肿瘤与原发性肿瘤相比，CCR7以及抑制性免疫检查点PD-1、LAG-3和TIM-3的表达均较高。此外，在小鼠肿瘤模型中，CCR7表达升高的肿瘤细胞更容易发生腘窝淋巴结转移。随后，文章通过噬菌体展示生物淘选成功鉴定出一个CCR7结合肽TC6，该肽可特异性阻断CCR7/CCL19和CCR7/CCL21的相互作用。进一步引入D型氨基酸取代TC6肽的N端和C端，获得抗蛋白酶解的TC6-D3肽。该肽体外通过ERK1/2通路抑制肿瘤细胞迁移，体内抑制肿瘤生长和淋巴结转移，并有效恢复原发灶和淋巴结中T细胞的细胞毒性。综上所述，CCR7促进肿瘤细胞向淋巴结转移，并抑制淋巴结内的抗肿瘤免疫反应。利用TC6-D3肽特异性阻断CCR7通路，可显著降低淋巴结肿瘤负荷，促进原发灶中CD8+T细胞浸润，同时增强淋巴结内的抗肿瘤免疫反应。
单字母 H2N-lspLIFVTTPDt-OH
多字母 H2N-DLeu-DSer-DPro-Leu-Ile-Phe-Val-Thr-Thr-Pro-Asp-DThr-OH
氨基酸个数 12
分子式 C61H98N12O19
平均分子量(MW) 1303.5
L-肽的主要应用限制在于其易被蛋白酶降解导致稳定性低，而非天然D-氨基酸取代策略可以解决这一问题。因此，文章将TC6肽的N端和C端残基均用D-氨基酸取代，以提高其稳定性（图3A）。阻断实验表明，与TC6肽相比，TC6-D3对CCR7/CCL19相互作用保留了同等的阻断活性（图3B）。随后，反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定了TC6肽在与10%小鼠血清孵育后24小时内迅速完全降解，而TC6-D3肽在48小时后表现出较强的抗水解性（约70%）（图3C-E）。接下来，文章提取了CHOK1-mCCR7-EGFP和CHOK1-EGFP细胞的膜蛋白，并使用微柱层析（MST）技术测定了TC6-D3对CCR7的特异性亲和力。结果表明，TC6-D3与mCCR7-EGFP融合蛋白的解离常数为403nM，但与对照EGFP蛋白无相互作用，KD >1000μM（图3F、G）。此外，通过MTT法检测TC6-D3对细胞增殖的影响，结果显示TC6-D3对MC38-CCR7（GFP）细胞的增殖无显著抑制作用（图3H）。综上所述，开发了对CCR7通路具有高结合亲和力和阻断活性的多肽TC6-D3，该多肽表现出优异的生物稳定性和安全性。
文章预测了TC6-D3的结构，并进行了TC6-D3与CCR7受体的分子对接研究。结果显示，由于D型氨基酸取代，TC6-D3的N端区域发生了构象变化。此外，TC6-D3肽的L1、S2、D11和T12残基与CCR7受体上的关键氨基酸残基S246、D155和K69相互作用。这些结构变化与肽的固有构象灵活性和D型氨基酸取代密切相关。
多肽具有强大的抗肿瘤活性，有望成为传统疗法的一种有效替代选择。本研究利用噬菌体展示技术筛选出特异性阻断CCR7/CCL19和CCR7/CCL21相互作用的多肽TC6，并通过丙氨酸扫描和计算机分子对接技术，鉴定出TC6-D3肽的L1、S2和T12残基是其与CCR7的关键结合位点。鉴于TC6肽由L型氨基酸组成，水解稳定性较差，文章将其N端和C端分别替换为D型氨基酸，以延长其半衰期并增强其抗水解能力，命名为TC6-D3肽。该肽特异性结合CCR7-GFP，但不结合GFP，KD值为403nM。因此，文章假设TC6-D3肽占据了CCR7的关键位点并阻止CCR7与CCL19或CCL21的结合。
在本研究中，CCR7/CCL19或CCR7/CCL21相互作用通过调节ERK1/2信号通路促进细胞迁移和侵袭，并与淋巴转移相关。Westernblot分析显示，当用趋化因子CCL19或CCL21处理MC38-CCR7(GFP)或B16-CCR7肿瘤细胞时，磷酸化ERK1/2水平显著升高，而当添加TC6-D3肽时，磷酸化ERK1/2水平显著降低。相应地，CCL19在体外诱导MC38-CCR7(GFP)肿瘤细胞迁移，但TC6-D3肽抑制了CCL19的作用。综上所述，文章推测CCR7/CCL19和CCR7/CCL21趋化性的激活通过ERK1/2信号通路促进MC38细胞和B16细胞的迁移和侵袭。此外，TC6-D3肽通过阻断CCR7与CCL19/CCL21之间的相互作用，显著抑制ERK1/2信号，从而消除CCL19/CCL21对细胞迁移的影响。
癌细胞可以上调CCR7表达，使它们能够沿着淋巴管中的CCL19和CCL21梯度迁移到淋巴结。鉴于小鼠足垫组织中淋巴管丰富，文章开发了一种淋巴结转移模型，使肿瘤细胞从足垫转移到腘窝淋巴结，正如预测的那样，CCR7大大促进了B16和MC38细胞的转移和定植。此外，文章还发现，TC6-D3肽治疗可显著抑制肿瘤生长，增加肿瘤和腘窝淋巴结中CD8+T细胞的浸润，并显著减少从原发性肿瘤迁移到远处腘窝淋巴结的CCR7-GFP+肿瘤细胞数量。总的来说，文章的结果支持TC6-D3肽免疫疗法可能是治疗淋巴结转移的一种选择。
考虑到CCR7主要在树突状细胞和T细胞中表达，在刺激树突状细胞成熟、归巢和运输T细胞方面发挥重要作用，因此通过抗体或基因干预干扰CCR7通路时，检查了对树突状细胞募集和T细胞浸润的免疫相关副作用。然而，TC6-D3治疗组对树突状细胞和T细胞追踪以及CCR7+树突状细胞和CCR7+T细胞浸润至肿瘤和淋巴结未表现出明显的免疫抑制作用。此外，通过对主要器官进行H&E染色和对血清生化标志物的血液测试广泛评估了安全性。肽治疗组与生理盐水组相比没有显著差异。这可能归因于与抗体相比，CCR7靶向肽具有高亲和力、相对较短的循环半衰期以及不存在Fc介导的ADCC和CDC效应。
尽管TC6-D3具有预防肿瘤转移的能力，但仍存在一些值得进一步研究的局限性，例如CCR7在免疫细胞上的表达。因此，TC6-D3肽对免疫细胞功能的影响仍有待充分阐明。未来的研究应主要开发选择性结合肿瘤表达的CCR7并通过阻断CCL21/CCR7通路来抑制淋巴结转移，而非阻断免疫细胞及其抗肿瘤免疫反应的递送系统。此外，TC6-D3与CCR7的结合模式需要通过蛋白质结晶进行验证，以获得更清晰的结构信息。
综上所述，肿瘤细胞表达CCR7使其能够转移至邻近淋巴结，从而抑制效应T细胞的细胞毒性。文章通过噬菌体展示筛选和D型氨基酸替换技术，筛选并开发了靶向CCR7的TC6-D3肽，该肽特异性干扰CCR7/CCL19和CCR7/CCL21相互作用，从而抑制肿瘤细胞的迁移。TC6-D3治疗显著延缓肿瘤进展，表现为肿瘤生长减少，T细胞的抗肿瘤活性增强。
参考文献：doi.org/10.1007/s00262-025-03995-4
