研究背景

治疗性多肽因其高特异性、低毒性以及能够靶向传统小分子药物难以作用的蛋白-蛋白相互作用界面，在药物开发中具有重要价值。然而，多数多肽在体内半衰期极短，主要受蛋白酶降解、快速代谢和肾脏清除等因素限制，严重制约了其临床应用。将多肽与IgG抗体的Fc片段融合是延长半衰期的经典策略，但现有重组表达方法无法引入非天然氨基酸、环肽、寡核苷酸等非蛋白源性功能基团，而这些基团恰恰能提升多肽的稳定性和生物活性。因此，开发一种能够兼容非蛋白源性组分的Fc-多肽偶联物半合成方法具有重要的科学意义和应用价值。

研究内容总结

本研究报道了一种基于二硫键重新桥接（disulfide re-bridging） 的半合成策略，用于高效制备Fc-多肽偶联物。研究团队设计并合成了双二乙烯基嘧啶（BisDVP）双功能连接子，该连接子能够与还原后的IgG1 Fc片段上的四个半胱氨酸残基反应，恢复二硫键连接的同时引入炔基或DBCO等点击化学手柄。通过铜催化的叠氮-炔基环加成（CuAAC）或应变促进的叠氮-炔基环加成（SPAAC）反应，可将治疗性多肽（Afamelanotide和Exenatide）定点偶联至Fc蛋白上。所得Fc-Exenatide偶联物在体外cAMP活性测定中保留了与临床药物相当的生物活性，FcRn结合能力未受影响，且在C57BL/6J小鼠体内的半衰期延长至27–44小时，相较于游离Exenatide（~1.7–1.9小时）实现了显著提升。该平台为长效多肽药物的开发提供了一种无需重组工程化的高效通用策略。

图表解读

Figure 1 — Fc融合/偶联策略概览

该图对比了四种Fc-蛋白/多肽构建策略。（a）传统重组表达法：Fc与多肽以单一线性多肽链融合表达，无法引入非天然结构。（b）Novo Nordisk的Fc-胰岛素偶联物：使用双卤代乙酰胺连接子，需工程化Fc蛋白且仅针对胰岛素设计。（c）Thoreau等人的Fc-荧光团/生物素偶联物：利用双溴哒嗪二酮连接子实现Fc功能化，但未应用于治疗性多肽。（d）本文策略：采用BisDVP双桥接连接子，通过还原Fc二硫键后重新桥接，引入点击化学手柄，再与治疗性多肽偶联，实现了非重组途径的Fc-多肽偶联物高效制备。

Figure 2 — BisDVP连接子设计与Fc偶联表征

该图展示了三种BisDVP连接子（1含炔基、2含炔基和叠氮、3含DBCO）的化学结构，以及Fc蛋白的两种获取途径（木瓜蛋白酶酶切消化与重组表达）。经TCEP选择性还原后，BisDVP连接子与Fc反应生成偶联物6、7、8。LC-MS和还原SDS-PAGE分析表明，每个Fc蛋白成功引入一个连接子，产物纯度高、均一性好，且几乎未检测到"半Fc"副产物，证实了BisDVP能够有效恢复两条重链间的共价连接。

Figure 3 — Fc-BisDVP-AF488偶联物与血浆稳定性

该图展示了Fc-BisDVP偶联物6与AlexaFluor 488叠氮化物经CuAAC反应生成荧光标记偶联物9的过程。UV-vis分析显示荧光团与抗体的比例（FAR）为0.9，接近完全转化。在37°C人血浆中孵育14天的稳定性实验表明，BisDVP偶联物9未检测到荧光向血浆蛋白（如人血清白蛋白）的转移，而马来酰亚胺对照组在第4天即出现明显转移，证明BisDVP形成的硫醚键具有优异的抗逆迈克尔加成稳定性。

Figure 4 — Fc-Afamelanotide偶联物的多路径合成

该图展示了通过不同点击化学路径制备Fc-Afamelanotide偶联物的策略。（A-C）CuAAC路径：Fc-BisDVP-炔基6与叠氮修饰的Afamelanotide反应生成偶联物10，LC-MS和SDS-PAGE确认产物纯度高。（D-F）SPAAC路径：Fc-BisDVP-DBCO 7与Afamelanotide-DBCO反应生成11。（G-I）双功能化：偶联物11进一步与AF488叠氮化物反应生成双标记偶联物12，证实了该平台可正交连接两种不同功能分子。（J-L）重组Fc来源的SPAAC路径：Fc-BisDVP-DBCO 8与Afamelanotide-叠氮反应生成13，同样获得高纯度产物。

Figure 5 — Fc-Exenatide偶联物生物活性与FcRn结合

该图展示了Fc-Exenatide偶联物的制备与生物学评价。（A-C）经优化的一锅法反应条件（室温桥接、4°C SPAAC），成功制备Fc-Exenatide 15，LC-MS确认分子量符合预期。（D-E）cAMP活性测定显示：游离Exenatide EC50为7.8 pM，Exenatide-PEG24-叠氮为50.1 pM，Fc-Exenatide为139.8 pM，与临床药物度拉糖肽类似物相当（仅差约18倍），证明引入PEG间隔子有效保留了多肽活性。（F）FcRn结合免疫分析表明，Fc-Exenatide与对照IgG、未修饰Fc及度拉糖肽类似物的FcRn结合能力相当，证实铰链区的化学修饰未干扰FcRn结合界面。

Figure 6 — Fc-Exenatide体内药代动力学

该图展示了Fc-Exenatide在小鼠体内的药代动力学结果。（A）胰蛋白酶消化策略：Fc骨架产生3个可检测肽段，Exenatide产生中段和N端两个肽段，DPP4对N端的切割可被监测。（B）药代曲线：游离Exenatide仅在1小时时间点可检测，而Fc-Exenatide可持续检测至196小时。（C）非房室模型分析：完整Fc-Exenatide的半衰期为27–35小时，中段肽的半衰期为35–44小时，较游离Exenatide（~1.7–1.9小时）实现了数量级级别的延长，为BisDVP桥接策略提供了首个体内概念验证。

参考文献：文献DOI10.1039/D6SC02646J