1.Tag-assisted peptide synthesis (TAPS) 的技术特点与适用场景

Tag-assisted peptide synthesis（TAPS）是一种以液相合成为基础、以临时疏水标签作为分离手柄的多肽合成策略。其核心做法是在起始氨基酸或肽片段上连接可溶性疏水标签，使多肽链在溶液中按Fmoc化学逐步延伸。标签不进入最终产物，但在合成过程中改变中间体的相行为，使带标签多肽保留在有机相中，而过量氨基酸、偶联剂残留、脱保护副产物和其他小分子杂质可通过水相萃取去除。这个过程中，疏水性标签可以类比于固相合成的树脂（图1）。

TAPS的价值主要来自后处理方式的改变。固相多肽合成依赖树脂固定中间体，反应后需要反复过滤和大量有机溶剂洗涤；传统液相合成反应放大性较好，但每一步中间体分离往往复杂。TAPS将液相反应与标签辅助分离结合起来，在同一反应器中完成多轮偶联和脱Fmoc操作，并通过水相萃取替代大量固相洗涤，从而降低溶剂消耗、减少物料转移，并缩短生产周期。

在典型流程中，疏水标签先与首个氨基酸连接，随后依次进行Fmoc保护氨基酸偶联和Fmoc脱保护。每轮反应结束后，通过加入水进行萃取，小分子杂质进入水相，带标签多肽留在有机相。全长受保护多肽合成完成后，可通过浓缩和反溶剂沉淀实现分离，再在后续裂解步骤中去除标签和侧链保护基。部分序列还可通过沉淀或结晶获得较高纯度，减少最终制备级HPLC压力。

TAPS更适合具有放大需求的中等长度多肽、保护基较多的序列、液相后处理困难的片段，以及适合汇聚式合成的多肽API。其前提是标签必须在Fmoc循环中保持稳定，能够有效放大目标中间体与杂质之间的相分离差异，并且在最终阶段可以高效去除。标签过弱会降低分离效果，标签过强则可能导致中间体溶解性下降或影响偶联效率，因此标签结构、溶剂体系、萃取条件和裂解方式需要围绕具体序列优化。

2.近期TAPS多肽合成

2.1 Cetrorelix acetate

Avula等报道的Cetrorelix acetate合成，是近期tag-assisted peptide synthesis较有代表性的工艺案例。Cetrorelix是一个结构复杂的十肽，序列中包含多个D-氨基酸、非天然芳香氨基酸、Arg(Pbf)、Ser(tBu)、Tyr(tBu)等保护基单元，既有较强的疏水片段，也有碱性残基（图2）。此类多肽如果采用传统液相线性合成，每一步后处理都会面临中间体分离困难、萃取和沉淀稳定性不足、柱纯化负担重等问题。该研究的价值在于利用疏水标签把液相合成中的中间体分离转化为沉淀、过滤、洗涤和液液分配等更适合放大的操作。公开摘要也明确指出，该路线借助疏水标签实现了中间体的无柱色谱分离，并用于建立可放大的Cetrorelix acetate制备路线。

参考文献：doi.org/10.1021/acs.oprd.5c00284

这一路线采用5+5汇聚策略。C端五肽片段D-Cit⁶-Leu⁷-Arg(Pbf)⁸-Pro⁹-D-Ala¹⁰-NH-Tag通过氨基型疏水标签TAG-NH₂构建，N端五肽片段Ac-D-2-Nal¹-D-Phe(4Cl)²-D-3-Pal³-Ser(tBu)⁴-Tyr(tBu)⁵-OH则通过羟基型疏水标签TAG-OH辅助制备。两段五肽分别完成后，再进行片段缩合，得到受保护的十肽标签中间体，最后在强酸体系下完成侧链脱保护、标签去除和乙酸盐转化。

• C端五肽TAPS合成

研究者以氨基型疏水标签TAG-NH₂为起始载体（图3），首先将Fmoc-D-Ala-OH偶联到标签上，形成Fmoc-D-Ala¹⁰-NH-TAG。该步反应在2-MeTHF中进行，采用HOBt、EDC·HCl和DIPEA作为缩合体系，室温反应1小时即可完成。反应结束后，减压除去2-MeTHF，所得粗品加入10体积甲醇处理。甲醇在这里作为反溶剂使用，诱导带疏水标签的偶联产物从体系中析出。目标中间体以白色固体形式沉淀后，经抽滤收集滤饼，并用甲醇洗涤3次，以去除母液中残留的小分子试剂、副产物和甲醇可溶性杂质，最终以87%的收率得到Fmoc-D-Ala¹⁰-NH-TAG。

随后的Fmoc脱保护条件入下：Fmoc-D-Ala¹⁰-NH-TAG在2-MeTHF中以哌啶和DBU处理，低温起始后升至室温，总反应时间约1.5小时。脱保护完成后，减压除去2-MeTHF，所得固体粗品依次用1体积1 N HCl、10体积水、5体积2.5%碳酸氢钠水溶液进行浆洗，并在每次浆洗后通过过滤回收固体。酸洗主要用于去除哌啶、DBU及其相关盐类；水洗用于带走极性残留；碳酸氢钠水溶液用于中和并去除酸性杂质。随后再用10体积甲醇洗涤2次，进一步清除有机可溶性残留，得到H₂N-D-Ala¹⁰-NH-TAG，收率为84%。

后续反应重复之前的氨基酸缩合与Fmoc去保护操作。

• N端五肽TAPS合成

N端五肽酸片段的合成采用羟基型疏水标签TAG-OH，其操作与C端片段有所不同（图4）。研究者首先将TAG-OH与Fmoc-Tyr(tBu)-OH偶联，形成Fmoc-Tyr(tBu)-O-TAG。该步反应以DIPC为缩合剂，加入催化量DMAP，在2-MeTHF中室温反应1小时完成。

偶联结束后，体系加入环己烷进行稀释，随后依次用2.5%碳酸氢钠水溶液、水和盐水洗涤。有机相经无水硫酸钠干燥后直接进入下一步Fmoc脱保护。

随后的Fmoc脱保护使用哌啶和DBU组合，低温加料后升至室温反应约1.5小时。反应完成后，体系冷却至0–5 °C，并用1 M HCl将pH调至约7。该处理一方面中和脱保护体系中的碱，另一方面使哌啶、DBU及其盐类更容易进入水相。随后分出有机相，并继续用2.5%碳酸氢钠水溶液、水和盐水洗涤。有机相干燥后继续保留，用于下一步氨基酸偶联。

Ser(tBu)的引入则采用COMU和DIPEA体系。研究者在上一轮处理后的有机相中补加2-MeTHF，再加入Fmoc-Ser(tBu)-OH、COMU和DIPEA，室温反应30分钟完成偶联。后续D-3-Pal、D-Phe(4Cl)、D-2-Nal等氨基酸的引入继续沿用这一模式：在有机相中完成偶联或脱Fmoc，随后通过水相洗涤带走小分子残留，带标签中间体则留在有机相中继续进入下一轮反应。这样可以减少每一步中间体的单独分离、干燥、重新溶解和转移，提升片段延伸的连续性。

N端五肽序列完成后，研究者再进行去标签处理。受保护的带标签五肽在TFA、TFE和DCM组成的体系中室温反应30分钟，切除TAG-OH并释放出Ac-D-2-Nal¹-D-Phe(4Cl)²-D-3-Pal³-Ser(tBu)⁴-Tyr(tBu)⁵-OH。反应液经硅藻土过滤后，用DIPEA调至约中性，再分出有机层并用水洗涤。有机层经干燥后低温减压除去溶剂，最后用正庚烷沉淀，得到目标N端五肽酸片段。

TAPS片段缩合与Tag裂解/去保护

最终的片段缩合反应，研究者将带有疏水标签的C端五肽与已经去除标签的N端五肽进行5+5偶联（图5）。两者在2-MeTHF中反应，采用HOBt、EDC·HCl和DIPEA作为缩合体系，其中N端五肽略过量（1.2当量）。室温反应约1小时20分钟后，得到受保护的十肽标签中间体。

反应完成后，体系减压除去2-MeTHF，所得膏状粗品用甲醇处理。甲醇在这里同样作为反溶剂使用，诱导带疏水标签的十肽中间体析出。目标产物形成类白色固体后，经抽滤收集，并用甲醇多次洗涤，以去除未反应片段、缩合剂残留、脲类副产物以及其他甲醇可溶性杂质。经过这一沉淀和洗涤过程，受保护十肽标签中间体以88%的收率获得。

全局脱保护阶段采用TFA、TIPS和水体系，完成侧链保护基去除和标签切除，最终经制备级HPLC纯化得到Cetrorelix acetate。

2.2 n-C14-surfactin

n-C14-surfactin（图6）的化学合成难点集中在两个方面：一是七肽环与β-羟基脂肪酸共同构成的depsipeptide结构需要兼顾肽键与酯键构建；二是最终宏环化容易受到二聚、寡聚和局部构象限制影响。

研究者采用可溶性疏水标签辅助液相多肽合成，将[2,4-双（二十二烷氧基）苯基]甲醇作为疏水Tag，并选择Glu侧链羧基作为标签连接位点，使线性前体能够在带Tag状态下完成逐步延伸和on-tag宏内酰胺化。

参考文献：doi.org/10.1016/j.tetlet.2025.155934

合成路线从Fmoc-Glu-OAll负载到疏水标签开始（图7）。以Tag为计量基准，在二氯甲烷中配制0.05 M反应体系，加入Fmoc-Glu-OAll、DIC和催化量DMAP，室温反应完成酯化负载。反应结束后，向体系中加入5–10倍体积乙腈，并降温至0 °C搅拌30 min–1 h。乙腈作为反溶剂，使带疏水标签的Fmoc-Glu(OTag)-OAll沉淀析出。沉淀经过滤和乙腈洗涤后，即可作为后续肽链延伸的起始中间体。

该路线随后在第二步引入(R)-3-hydroxytetradecanoic acid。脂肪酸片段较早接入有助于降低后续中间体形成DKP的风险。脂肪酸偶联后，带标签中间体继续依靠乙腈沉淀和洗涤进行处理。由于疏水标签使目标中间体在高极性乙腈体系中溶解度显著降低，反应后不需要反复分离复杂油状物，而是通过沉淀、过滤和洗涤得到可进入下一步的固体中间体。

该路线的肽链延伸主要采用一锅式偶联与Fmoc脱保护串联操作（即氨基酸缩合之后不进行workup而直接脱Fmoc）。具体条件为，带标签肽在DMF/THF = 1:4中配制为0.05 M溶液，加入1.2当量Fmoc-AA-OH，预搅拌20 min后，加入1.2当量DMT-MM和1.5当量NMM，室温反应20 min–2 h。TLC确认偶联完成后，不分离中间体，而是在同一反应体系中加入1.5当量40% MeNH₂/MeOH溶液，室温搅拌30 min，用于淬灭过量活化氨基酸。随后加入4.0当量DBU，室温反应20–50 min完成Fmoc脱保护。脱保护完成后，加入8.0当量6 M HCl水溶液中和DBU并诱导分层，取有机层后加入5–10倍体积乙腈，在0 °C搅拌30 min–1 h，使带标签中间体沉淀析出。固体经过滤和乙腈洗涤后，可直接进入下一轮延伸。

构建depsipeptide结构时，脂肪链上的二级羟基需要与Fmoc-Leu-OH发生酯化。研究者最初采用DIC/DMAP条件，但观察到Leu位点约5%消旋。后续条件筛选改用改良Yamaguchi酯化体系，以2,4,6-trichlorobenzoyl chloride（TCBC）、DIPEA和DMAP完成羧酸活化与酯化。该条件降低了Leu消旋，并得到更干净的酯化中间体。对n-C14-surfactin这类含β-羟基脂肪酸的环状脂肽而言，该酯化步骤直接影响线性前体质量，也影响后续环化收率。

线性前体完成后，需要同时去除烯丙基保护基和Fmoc保护基，为宏内酰胺化提供游离羧酸和游离氨基。研究者在氩气保护下，将带标签肽溶于THF，浓度约0.04 M，加入0.5–1 mol% (PPh₃)₄Pd和3.0当量morpholine，室温反应30 min–2 h完成烯丙基去保护。TLC确认反应结束后，加入2.5当量DBU，继续反应20 min–1 h完成Fmoc脱保护。随后加入8.0当量6 M HCl水溶液中和并分层，有机层加入10倍THF体积的乙腈，在0 °C搅拌30 min–1 h，使去保护后的线性环化前体沉淀析出。

宏内酰胺化是Glu路线的关键放大步骤。研究者比较了EDCI、COMU、DEPBT、PyOxim等缩合体系，最终确定PyAOP体系更适合该线性前体环化。在50–100 mg规模下，PyAOP/HOAt/DIPEA在二氯甲烷或THF中均能给出较好结果。放大到十克级时，研究者采用1.8当量PyAOP和3.8当量DIPEA，以THF为溶剂，控制终浓度为20 mM，在40 g规模完成on-tag宏内酰胺化，并以84%收率获得带标签宏环产物。

宏环产物随后进行酸性全局脱保护和去标签。底物溶于二氯甲烷，浓度为0.05 M，加入等体积TFA/TIS/H₂O = 95:2.5:2.5裂解体系，室温反应1–4 h。反应完成后减压浓缩，并用甲苯共沸两次去除残余酸。浓缩物加入甲醇制成悬浊液，经Celite过滤去除不溶物，滤液再浓缩。最终用己烷打浆洗涤，得到脱保护并去标签后的n-C14-surfactin。

该路线从Fmoc-Glu-OAll负载到Tag起算，共13步，总收率达到72%，并实现17.5 g高纯n-C14-surfactin制备。

3.Cyclover案例：T3P参与的疏水标签辅助液相多肽合成

Kushwaha等报道的Cyclover辅助液相多肽合成，将水不溶性疏水标签与T3P缩合体系结合，用于建立一套可通过沉淀或萃取处理的LPPS流程。该路线的核心组件是Cyclover标签，即2-(4′-piperazino)-4,6-di[N,N-di(n-octadecyl)amino]-1,3,5-triazine（图8）。Cyclover含有两个长链十八烷基取代氨基，整体疏水性很强，可溶于toluene、anisole、cyclohexane、2-MeTHF和DCM等非极性或弱极性有机溶剂，在水、甲醇、乙腈、乙酸乙酯和丙酮中溶解性较低。这个溶解性窗口决定了其工艺处理方式：反应阶段可在2-MeTHF或DCM中保持均相，反应结束后则可通过乙腈诱导沉淀，或通过酸碱水洗将小分子副产物转入水相。

参考文献：doi.org/10.1021/acs.orglett.6c00353

该研究首先制备H-RinkAmide-Cyclover起始载体。Cyclover与Rink amide linker按1.0:1.2投料，在2 mL 2-MeTHF中加入4当量T3P和8当量DIEA，室温反应30 min。反应终点通过TLC确认，并取少量反应液用乙腈沉淀后再用TLC和HPLC检查Cyclover消耗情况。Fmoc-RinkAmide-Cyclover形成后，不分离中间体，直接向反应液中加入16当量piperidine，室温搅拌30 min完成原位脱Fmoc。脱保护结束后，以0.1 N HCl水溶液中和体系，再加入5体积乙腈，使H-RinkAmide-Cyclover沉淀析出（图9）。沉淀经离心收集后，用5体积乙酸乙酯洗涤两次，干燥得到起始底物，分离收率为98%。

模型肽合成以Leu-enkephalin为对象，先建立偶联、原位脱Fmoc和沉淀分离循环。以第一轮Leu引入为例，0.067 mmol H-RinkAmide-Cyclover与1.2当量Fmoc-Leu-OH溶于2 mL 2-MeTHF，加入DIEA将体系pH维持在约9，再加入50% T3P/EtOAc溶液。由于2-MeTHF中微量水分会消耗T3P，初始4当量T3P不足以保证完全缩合，研究者补加4当量T3P后实现完全转化，因此2-MeTHF体系中每轮偶联的实际T3P用量为8当量。反应在室温下进行，约30 min内完成，终点通过TLC和茚三酮检测确认。

偶联完成后，反应液不进行中间体分离，直接加入16当量哌啶，室温反应30 min完成Fmoc脱保护。随后用酸中和，再加入5体积乙腈诱导带Cyclover标签的肽中间体沉淀。沉淀经离心收集，并用乙酸乙酯洗涤两次，得到下一轮偶联底物。该循环依次用于Leu-enkephalin序列延伸，直至获得H-Y(tBu)-GGFL-RinkAmide-Cyclover（图10）。每轮偶联和脱保护均通过TLC和茚三酮反应监测。

全长标签肽完成后，采用TFA/TIS/H₂O = 95:2.5:2.5裂解体系，在100 mg/mL浓度下反应2 h，使多肽从Rink amide-Cyclover上释放。裂解液先旋蒸除去部分TFA，再加入10倍体积冷TBME沉淀目标肽。沉淀经离心收集，并用TBME洗涤两次，得到Leu-enkephalin。采用2-MeTHF和逐轮沉淀处理时，Leu-enkephalin分离收率为90%。

研究者随后用DCM替代2-MeTHF进行对照，其余操作保持一致。DCM体系完成同一模型肽合成所需T3P总量降低至6当量。该结果与溶剂含水量有关：2-MeTHF更容易带入或累积微量水分，导致T3P部分水解；DCM吸湿程度较低，有效缩合剂损失更少。两种溶剂所得粗品纯度接近，说明2-MeTHF虽然需要更高T3P用量，仍可作为该Cyclover-T3P体系的反应介质。

在沉淀流程基础上，研究者进一步建立了萃取式分离路线。偶联仍在2 mL 2-MeTHF中进行，使用8当量T3P和16当量DIEA，并将pH维持在约9。偶联完成后直接加入哌啶进行原位脱Fmoc。该路线中哌啶用量提高至32当量，用于充分形成DBF-piperidine加合物。脱保护结束后，反应体系依次用等体积0.1 N HCl、NaHCO₃溶液和brine各萃取一次，再用无水MgSO₄干燥2-MeTHF层。目标标签肽保留在有机层中，T3P水解副产物、酸碱盐、DIEA盐、哌啶及部分极性残留通过水相去除。处理后的有机层直接进入下一轮偶联。

获得H-Y(tBu)GGFL-RinkAmide-Cyclover后，再加入10 mL乙腈和10 mL乙酸乙酯，使全长标签肽沉淀，同时去除DBF-piperidine加合物。沉淀产物随后按相同TFA/TIS/H₂O条件裂解2 h，并以冷TBME沉淀目标肽。该萃取流程下，Leu-enkephalin分离收率提高至93%，粗品纯度超过98%，PMI由逐轮沉淀流程的8426降至3182。

这个案例的工艺重点在于Cyclover标签与T3P副产物性质之间的匹配。Cyclover保证标签肽在2-MeTHF中反应、在乙腈或乙酸乙酯体系中沉淀；T3P参与缩合后生成水溶性丙基膦酸副产物，适合通过酸碱萃取移除。沉淀流程操作直接，适合验证标签体系；萃取流程减少每轮中间体分离和干燥，更有利于降低PMI和提升粗品纯度。Cyclover-T3P组合由此提供了一种以2-MeTHF为反应溶剂、以水洗和末端沉淀为主要处理手段的tag-assisted LPPS方案。