尽管基于纳米颗粒（NP）的给药系统发展迅速，但由于各种生物屏障，静脉给药到大脑仍然是一个主要挑战。np包被药物要达到治疗效果，必须避免在非靶器官的积累，并有选择性地递送到大脑，成功地穿过血脑屏障（BBB），到达大脑内的靶细胞。将受体特异性配体偶联到NPs表面是一种很有前途的工程NPs技术，可以克服这些障碍。具体来说，肽作为脑靶向配体由于其易于合成、低细胞毒性和与靶蛋白的强亲和力而越来越受到关注。多肽作为靶向配体的成功很大程度上归功于设计和修饰具有良好性能的多肽的多种策略，包括膜渗透性和多受体靶向性。在这里，我们回顾了肽功能化NP系统在神经疾病应用中的设计和实现。我们还探讨了针对大脑靶向的合理肽设计策略的进展，包括使用生成式深度学习模型来计算设计新肽。
对于神经系统疾病的治疗，包括神经胶质瘤、阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）等，开发可以静脉注射的非侵入性治疗方法仍然是一个挑战。纳米颗粒（NPs）是一种强大的药物递送载体，特别是对于包括RNA疗法和CRISPR/Cas9基因编辑蛋白在内的大分子药物递送。NP包封治疗药物的优点包括延长循环时间，通过胞吞作用有效地通过细胞膜运输，在靶组织中控制释放，有效的药物装载和减少副作用。尽管NPs具有显著的优势，但由于肝脏和脾脏的自然清除以及生物屏障BBB的存在，NPs在靶组织的递送和生物分布方面仍然存在局限性。人体内最具限制性的生物屏障之一是血脑屏障（BBB），这是一种半透性屏障，可以阻止98%的小分子药物和100%的大分子药物从血流中进入脑实质。血脑屏障由一层脑毛细血管内皮细胞（BCECs）组成，由紧密连接、星形胶质细胞、周细胞和神经元连接，只允许选定的分子通过.
由于它们的体积相对较大，NPs主要通过胞吞作用穿过脑内皮进入大脑。增加胞吞作用的一种方法是主动靶向，其中对特定受体具有高亲和力的配体与NPs结合以促进受体介导的胞吞作用（RMT）。在RMT中，靶向配体介导NPs与bcec表面受体的结合，诱导形成内体，内体吞噬NPs并将其通过细胞外排作用释放到脑实质。然而，一些挑战，包括不可预测的摄取途径，外排转运体的清除，以及脑内皮腔侧的胞吐失败，可以通过主动靶向抑制RMT的疗效。此外，NPs在胞吞作用过程中可能遭遇酸性降解和溶酶体再循环，这对含有细胞内机制（如基因编辑和核酸治疗）的治疗载体的NPs构成了额外的挑战.
已经探索了几种类型的配体用于血脑屏障靶向和交叉，包括抗体，蛋白质，肽和特异性结合血脑屏障上丰富的受体的适体。多肽具有几种特性，使它们成为表面功能化的最佳配体。这些特点包括分子量小，易于合成，细胞毒性和免疫原性低。此外，多肽是合理工程的强大平台，可以实现不同的主链和侧链修饰、环化和与其他化学基团的偶联（图1）。
图1 肽功能化纳米颗粒（NPs）用于靶向治疗通过血脑屏障（BBB）。概述示意图描绘了不同类型的NPs携带不同的多肽功能化的治疗货物。这些肽靶向在脑血脑屏障毛细血管内皮细胞上过表达的受体，促进受体介导的内吞作用和随后的脑实质运输。然后，这些靶向NPs可以结合在感兴趣的疾病细胞类型（如胶质瘤细胞）上过度表达的受体
本综述涵盖了已建立的脑靶向肽的领域，这些肽已与多种NPs结合，用于神经系统疾病药物的静脉输送，重点介绍了肽用于BBB特异性靶向和交叉的前景。此外，我们还讨论了用于增强药物进入细胞的细胞穿透肽类。我们回顾了将多肽整合到NPs传递系统中的合理设计策略，并从引入化学修饰到融合多个多肽来增强多肽的性能。最后，考虑到大脑中不同细胞类型和疾病表型上表达的大多数受体没有现有的肽结合物，我们强调了通过生成式深度学习模型从头设计肽的新兴领域。本综述旨在通过合理设计递送载体来促进基于NPs的神经系统疾病精确治疗的发展，这些递送载体可以被重新用于有效地递送任何治疗货物。
肽如RVG29、T7、Angiopep-2 （Ang）和mApoE已成为促进np包封治疗药物跨血脑屏障递送的关键工具。这些肽与 BCECs或神经元细胞表面高表达的受体结合，因其增强血脑屏障交叉的能力而被广泛研究（表1）。这些肽功能化的NPs已经证明了药物递送效率的实质性提高，能够通过血脑屏障运输并增强细胞摄取。特别是，肽偶联的NPs在实现基因敲除和基于核酸的基因编辑等应用的有效细胞质递送方面显示出了希望。这些肽不仅为优化表面偶联策略和开发双靶向制剂提供了基础，而且还推动了下一代递送肽的合理设计。
RVG29肽
RVG29是一种由狂犬病毒糖蛋白衍生的29个氨基酸的肽，它特异性结合烟碱乙酰胆碱受体（nAchR），在BCECs和神经元上表达，以及γ -氨基丁酸（GABA）受体也在神经元上表达。受狂犬病毒等嗜神经病毒在体内克服血脑屏障能力的启发，Kumar等人首次发现RVG29可以在体外特异性结合表达nAchR的Neuro2a神经元细胞，并在体内进入小鼠大脑。RVG29与游离小干扰RNA （siRNA）偶联后，静脉注射GFP转基因小鼠后，RVG29还能促进脑内特异性基因沉默，表明RVG29不仅能促进脑内BBB的交叉，还能促进体内的脑细胞转染。鉴于这些有希望的结果，RVG29已被偶联到各种基于NPs的系统上，以提高生物利用度和血清半衰期，包括聚酰胺胺树状大分子、脂质体、固体脂质纳米颗粒和可电离脂质纳米颗粒，用于输送各种货物。值得注意的是，Han等人表明，RVG29共轭的可电离脂质纳米颗粒（LNPs）在静脉注射健康成年小鼠后，使脑内BBB交叉和荧光素酶mRNA转染增加了70倍。此外，流式细胞术分析显示，包封mCherry mRNA的RVG29 LNPs导致神经元转染从1.2%增加到~ 2.4%，内皮细胞转染未增加，这表明RVG29可以促进mRNA穿过血脑屏障进入脑实质。
与健康细胞相比，胶质瘤细胞上的nAchR表达增加了两倍，使rvg29结合的NPs能够穿过血脑屏障并特异性递送到胶质瘤区域[17]。Hua等人证明，与未修饰的NPs相比，RVG29修饰的PEG-PLGA NPs在大鼠模型bb0中使多西紫杉醇的体内脑浓度增加了2.1倍，存活时间延长了7天。
由于β -位点淀粉样蛋白前体蛋白切割酶-1 （BACE1）的表达促进神经元死亡和认知能力下降，神经元成为治疗AD的靶点。由于RVG29靶向神经元表面丰富的nAchRs和GABA受体，一些研究已经研究了RVG29功能化的NPs治疗AD。Alvarez-Erviti等人发现，RVG29结合的外泌体增强了BACE1 siRNA向神经元、小胶质细胞、少突胶质细胞及其前体的传递，并在C57BL/6小鼠中静脉注射后导致脑组织中62%的蛋白敲低。阿尔茨海默病的另一种治疗策略是将抗氧化剂输送到神经元的线粒体，以减少氧化应激，这与a&β的产生有关。Han等人开发了双功能化固体脂质纳米颗粒（SLNs），其中含有RVG29，用于BBB和神经元靶向，以及带正电荷的三苯基膦阳离子（TPP），用于内化后特异性递送到带负电荷的神经元线粒体。与单功能SLNs相比，这种方法在体外促进了神经元HT22细胞活性氧（ROS）和凋亡率的更高降低，这与AD小鼠模型的体内结果一致。
由于帕金森病（PD）是黑质多巴胺能神经元丧失的结果，RVG29也被偶联到脂质体、聚合纳米颗粒和外泌体上，以靶向神经元治疗PD。值得注意的是，Qu等人将RVG29偶联到脂质体上，有效地将多巴胺衍生物BPD通过血脑屏障传递到纹状体和黑质，以治疗PD。导致多巴胺水平比PD小鼠模型中的游离药物增加更多。
T7肽
T7是一种由7个氨基酸组成的肽，特异结合BCECs和胶质瘤细胞上表达的转铁蛋白（Tf）受体（TfR），结合的亲和力与内源性Tf相似。此外，T7的结合位点与内源性Tf不同；因此，高浓度的内源性Tf不会抑制T7的结合，反而会促进T7的结合增强。T7最早由Lee等人通过噬菌体展示发现，发现T7可以促进绿色荧光蛋白（GFP）内化到表达TfR的细胞中。
TfR在胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞中过度表达，这是由于它们在细胞代谢和增殖中的作用；因此，T7已被广泛用于胶质瘤和胶质母细胞瘤治疗的递送，包括siRNA、反义microRNA（miRNA）和小分子药物。值得注意的是，T7与聚乙二醇化胆红素NPs（PEGylatedbilirubinNPs,BRNPs）结合后，脑穿透能力提高了7.89倍，体外培养后C6胶质瘤细胞凋亡率达到74.1%，这与C6细胞增殖过程中TfR的过表达一致。此外，在胶质瘤小鼠模型中，与非靶向NPs相比，装载cediranib（CD）和紫杉醇（PTX）的T7偶联BRNPs可延长存活时间10天，这表明T7在脑内递送药物中的关键作用。此外，T7功能化的NPs已被探索用于RNA治疗的传递和转染。具体来说，直径30至100nm的t7修饰外泌体装载了针对miR-21（AMO-21）的反义miRNA寡核苷酸，用于胶质母细胞瘤治疗，在颅内胶质母细胞瘤大鼠模型中，肿瘤大小减少了50%以上。由于AMO-21需要与细胞质中的miRNA结合才能抑制活性，这表明T7在促进其通过血脑屏障的运输和转染靶细胞方面是有效的。
T7也被用于脑卒中治疗的神经保护药物ZL006的靶向递送。T7偶联聚乙二醇化脂质体能够显著降低脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠模型缺血引起的梗死体积和神经功能缺损。为了增强靶向作用，Zhao等人用T7和脑卒中归巢肽（SHp） （CLEVSRKNC）功能化脂质体，这些脂质体在脑卒中缺血阶段由于谷氨酸的过度释放而选择性地积聚在小鼠的缺血区域。双靶向脂质体能够显著降低缺血诱导的神经细胞死亡，TUNEL-阳性细胞减少11.3%。
在广泛探索的脑靶向肽中，T7具有最短的氨基酸序列长度，可以阻止NP大小的显着增加，并且可以在NP表面进行更高密度的偶联以增强结合亲和力。此外，TfR在癌细胞中过表达超过100倍，使其成为胶质瘤靶向治疗的有效配体。然而，考虑到TfR在包括肝和肺在内的几乎所有组织中的表达，未来的工作应侧重于T7与其他脑特异性靶向配体的NPs系统的双功能化或通过合理设计来增强T7的脑特异性。
Angiopep-2肽
Angiopep-2 （Ang）是一种19个氨基酸的肽，靶向低密度脂蛋白受体相关蛋白1 (LRP1)，该蛋白在血脑屏障和胶质瘤细胞上高度表达。考虑到与包括Tf在内的血脑屏障透性蛋白相比，抑蛋白蛋白在血脑屏障上的转运增加了十倍，Demeule等人从负责转运的区域中获得了一个肽库，并使用多序列比对发现了蛋白质中可能影响蛋白质功能的同源区域。在体外血脑屏障模型中，从衍生肽来看，Ang的胞吞作用比抑酶蛋白增加了7倍。这促使Ang与各种NP递送系统结合，用于血脑屏障和脑靶向治疗。
除了血脑屏障外，Ang还可以促进参与各种中枢神经系统（CNS）疾病（包括AD、PD、中风、疼痛和癫痫）的神经胶质细胞的增强定位。Huile等人设计了Ang功能化的PEG-PCLNPs，用于靶向BBB，EGFP-EGF1蛋白用于靶向神经胶质细胞。该方法使神经胶质细胞对NP的摄取增加了1.41倍与未修饰的NPs相比，BCECs增加了2.08倍，并且在离体大鼠模型中与单一功能化的NPs相比，显示出与神经胶质细胞的共定位增强。
由于LRP1在血脑屏障和胶质瘤细胞上高度表达，一些研究将Ang偶联到各种NPs上，包括聚酰胺胺树突（PAMAM）、PEG-PCL NPs、脂质体、串联纳米胶束和小细胞外囊泡（sEVs），用于靶向胶质瘤。Straehla等人设计了一种新的血脑屏障胶质母细胞瘤（GBM）微流控模型，该模型将肿瘤球体嵌入自组装的血管内皮层，模拟血脑屏障。Ang-共轭NPs在BBB- GBM模型中的通透性明显高于非肿瘤BBB模型，表明肿瘤周围微血管中LRP1的丰富度更高。ssEVs与Ang和细胞穿透肽TAT的双重功能化已被证明可促进血脑屏障运输，随后在小鼠血脑屏障中靶向和穿透胶质瘤。由于协同靶向血脑屏障和细胞渗透，双功能化sev在体内的脑和肿瘤区域的信号分别比单修饰的Ang和TAT sEVs强两倍和三倍，这转化为抑制胶质瘤生长和延长生存时间.
尽管Ang具有血脑屏障和胶质瘤细胞靶向特性，但更深的穿透肿瘤结构仍然是治疗效果的障碍。为了避免这种情况，Gao等人提出了一种针对NP的双期胶质瘤，该胶质瘤用Ang和可激活的细胞穿透肽（ACP）功能化，将多西他赛（DTX）递送到胶质瘤部位。本研究中使用的ACP由阴离子E8序列和阳离子R8序列（PLGLAG）组成，该序列是C6胶质瘤细胞上高表达的基质金属蛋白酶-2 （MMP-2）的底物。由于E8和R8之间的静电相互作用，R8的细胞穿透性能受到抑制。首先，Ang通过LRP1介导的内吞作用促进NPs穿过血脑屏障到达胶质瘤细胞。MMP-2在胶质瘤位点将E8序列与NP分离，留下阳离子R8肽，以促进渗透到胶质瘤细胞中。与单功能NPs相比，双功能NPs在Balb/c小鼠的胶质瘤区域显示出更好的定位。总之，Ang作为一种多用途配体，在单配体和双配体NPs中都能显著增强BBB靶向性。
mApoE肽
mApoE是一种由12个氨基酸组成的肽，是人载脂蛋白E （ApoE）的一个片段，与三种低密度脂蛋白受体（LDL）具有高结合亲和力，包括LDLR和LDLR相关蛋白1和2 (LRP1和LRP2)，与其他组织和胶质瘤细胞相比，BCECs上过表达。ApoE是一种血清蛋白，可促进脂质通过LDL受体从血液转运到中枢神经系统[53,54]。从ApoE中，ApoE的氨基酸141&ndash；155的串联二聚体重复序列，称为dApoE，被证明保留了与LDLR的结合亲和力。在发现dApoE之后，Re等人比较了bbecs中dApoE及其组成单体序列mApoE偶联脂质体的摄取，发现无论在低表面密度还是高表面密度下，mApoE都表现出更高的摄取。该研究提示了多种NPs与mApoE的功能化，用于BBB靶向和交叉。
多项研究将载脂蛋白 E（mApoE）和磷脂酸（PA）共轭于脂质体上，以结合阿尔茨海默病（AD）中大量存在的β-淀粉样肽（Aβ）。巴纳等人证明，共轭有 mApoE 和 PA 的脂质体能够以时间和剂量依赖的方式分解 Aβ 斑块，旨在破坏不溶性 Aβ 聚集体。相比之下，单一功能化的脂质体没有效果，这是由于带正电荷的 mApoE 肽与带负电荷的 PA 之间存在协同静电相互作用，它们与 Aβ 肽中带不同电荷的残基相互作用。这种方法使转基因小鼠海马体和皮质中 Aβ 斑块的大小减少了 34%，脑内不溶性 Aβ1–42 总量减少了 33%，脑 Aβ 低聚物减少了 70.5%，这与突触功能障碍和疾病严重程度密切相关。同时，单一功能化的脂质体没有显著效果。
虽然mApoE功能化脂质体在hCDMEC/D3 transwell模型中显示内皮通透性增加了10倍，但Formicola等人证明，与未修饰的脂质体相比，mApoE和CITx肽的双重功能化可以进一步增强内皮通透性30倍。研究表明，CITx与膜联蛋白A2相互作用，参与病原体跨血脑屏障的胞外分泌，表明双功能脂质体通过mApoE进行ldl受体介导的内吞作用，并通过CITx与膜联蛋白A2结合增强胞外分泌。
尽管mApoE获得了成功，但dApoE也被偶联到脂质体和嵌合聚合体上，用于靶向LDLR、LRP1和LRP2。与mApoE相比，dApoE对内皮细胞（RBE4细胞）的吸收较低，但内皮细胞单层的通透性较高，这表明dApoE减少了内皮层的积聚，促进了血脑屏障的运输。与先前报道的五种血脑屏障穿透肽（Angiopep-2、CDX、HAI、SynB1和Tat）相比，dApoE功能化脂质体在小鼠脑内的蓄积更强，比未修饰的脂质体的蓄积高3.9倍。
鉴于低密度脂蛋白受体（LDLR）在胶质母细胞瘤（GBM）的发展过程中表达上调，载脂蛋白 E（ApoE）可作为双功能配体，用于靶向血脑屏障（BBB）并递送至胶质母细胞瘤细胞。与未修饰的嵌合聚合物囊泡（CPs）相比，用 ApoE 肽功能化的 CPs 在体外增强了 4.8 倍的血脑屏障转运能力，与血管紧张素（Ang）功能化的 CPs 相比增强了 2.2 倍，这可能是由于与 LDLR 家族中的多个受体相互作用所致。载有皂草素的 ApoE-CPs 在携带胶质母细胞瘤的小鼠体内也显示出对肿瘤的深度渗透，并完全抑制了与疾病相关的体重减轻。
Cell-penetrating肽
由于包括核酸和基因编辑在内的大部分治疗方法需要进入细胞的细胞质才能达到治疗效果，因此靶向血脑屏障往往是不够的。因此，各种研究已经探索了NPs与一类可以穿透细胞膜的肽的功能化，称为细胞穿透肽（CPPs）（图2）。CPPs是由携带蛋白质转导结构域的蛋白质衍生的5 - 30个氨基酸短肽，可以穿透细胞膜。由于精氨酸(R)和赖氨酸(K)残基的存在，大多数CPPs在生理pH下带正电。CPPs可以通过受体介导的胞吞作用、吸附介导的胞吞作用或直接扩散穿过脂质双分子层。
图2 合理设计策略，提高肽靶向效果。这张示意图描绘了增强肽靶向以使纳米颗粒递送到大脑的各种策略，包括设计具有特殊连接物的融合肽，利用细胞穿透肽，改变肽的立体化学，以及环化肽。内圈显示了设计策略，外圈突出了这些策略提高脑靶向效果的具体方式
细胞穿透肽功能化纳米颗粒
鉴于其能够克服受体饱和并长期保持稳定的细胞摄取能力，多项研究已将细胞穿透肽（CPPs）与脑特异性靶向配体共同功能化到纳米颗粒（NPs）上。TAT（GRKKRRQRRRPPQ）是一种广泛研究的源自 HIV-1 病毒的细胞穿透肽，能够在多种组织中高效穿过细胞膜。用 TAT 细胞穿透肽修饰的金纳米颗粒已被证明能使携带胶质母细胞瘤（GBM）的小鼠体内脑部积累量增加 4.8 倍。夏尔马等人通过将三种不同的细胞穿透肽（包括 TAT、穿膜肽和肥大细胞脱粒肽）共价连接到转铁蛋白（Tf）功能化的脂质体上，比较了它们的血脑屏障（BBB）转运能力，并发现与单独功能化的 Tf 或 CPP 脂质体相比，这三种细胞穿透肽在三维脑肿瘤模型中均显著改善了转运。在这三种细胞穿透肽中，Tf-穿膜肽和 Tf-TAT 脂质体在体外脑肿瘤模型中显著增强了脑部渗透，分别达到每克组织 3.67%和 2.89%的注射剂量。此外，用于治疗胶质母细胞瘤的 TAT 结合介孔二氧化硅纳米颗粒（MSNs）输送甲氨蝶呤（MTX）在小鼠脑部的蓄积量比游离药物显著增加了 31.1 倍，而未经修饰的 MSNs 仅增加了 2.8 倍。
CPPs具有独特的定位，可以促进信使RNA （mRNA）、siRNA和miRNA等核酸药物的递送，因为它们能够穿过细胞膜进入细胞质，这些治疗药物可以激活或抑制各种蛋白质的基因表达。具体来说，Srimaneea等人开发了一种将siRNA递送至胶质母细胞瘤细胞的系统，通过将LRP1靶向肽Ang修饰为N端带有6-氨基己酸连接物的六角氨酸（E6）序列，从而产生一种阳性肽TG1，该阳性肽TG1可以与带负电荷的CPP PepFect14 （PF14）非共价相互作用。由此产生的PF14:siRNA/TG1 NP复合物促进了U87胶质瘤细胞中80%的荧光素酶表达下调，比单独的CPP增加了两倍，这表明结合各种肽的细胞穿透能力和脑和胶质瘤靶向能力形成最佳配体的有效性。
CPP功能化的局限性
尽管取得了有希望的结果，但用于脑部递送的 CPP 功能化纳米颗粒仍存在各种局限性，包括非特异性细胞穿透和细胞毒性增加。由于 CPP 通过非特异性机制（包括吸附介导的内吞作用）增强所有组织和细胞类型的渗透，将 CPP 共轭到纳米颗粒上可能会增加对其他器官或非病变细胞的脱靶效应。为克服这些局限性，已提出的策略包括用靶向肽屏蔽 CPP、将靶向序列共轭到 CPP 上以及引入 pH 激活型 CPP。
为了防止CPPs诱导的非特异性细胞渗透，Zhu等人通过长PEG连接物（PEG6000）将RMT靶向肽Ang偶联到NPs上，通过短PEG连接物（PEG2000）将TAT CPP偶联到NPs上。Ang在血液循环中屏蔽TAT肽，但当Ang与血脑屏障和胶质瘤细胞上的LRP-1结合时，TAT离细胞膜足够近，从而诱导渗透。与Ang-单一修饰的NPs和未修饰的NPs相比，该方法使体外血脑屏障转运增加了1.8倍和4.2倍，使胶质瘤小鼠的中位生存时间分别延长了9天和20天。
刘等人设计了一种融合肽，由细胞穿透肽八精氨酸（R8）与 RGD 的反向异构体 dGR 连接而成，称为 R8-dGR，该融合肽保留了靶向表达于血脑屏障内皮细胞（BCECs）和胶质瘤细胞上的整合素αvβ3受体的能力。该序列 R8-dGR 还包含一个 RXXR 的 C 端基序，能够特异性结合表达于 BCECs 和胶质瘤细胞上的神经纤毛蛋白-1（NRP-1）受体，从而通过 C 端规则促进细胞摄取增加。当连接到脂质体上时，R8-dGR 肽在体外对血脑屏障单层的运输和胶质瘤细胞的细胞摄取，以及在小鼠体内对脑和胶质瘤区域的积累方面，均优于 R8-RGD（无 NRP-1 靶向）、R8-EGR（无整合素靶向）和 R8。
为克服药物难以渗透至肿瘤实质深层区域的问题，Shi 等人设计了一种融合肽，该肽由环状 RGD（一种靶向在脑血管内皮细胞和胶质瘤细胞上过度表达的整合素αvβ3 的肽）和 TH（一种在正常生理条件下略带负电荷但在肿瘤细胞附近 pH 值约为 6.5 时质子化并带正电荷的 pH 活性细胞穿透肽）组成。与环状 RGD 和 TH 功能化脂质体相比，负载紫杉醇（PTX）的这种融合肽偶联脂质体在 C6 球体中的渗透更深，并显著延长了荷胶质瘤小鼠的中位生存期至 45 天，而环状 RGD 和 TH 功能化脂质体分别延长至 38.5 天和 27 天。
为脑靶向纳米颗粒设计多肽
虽然现有的多肽是很有前途的血脑屏障靶向剂，但仍存在一些局限性，可以通过合理的工程来解决。其中包括缺乏各种疾病归巢和细胞类型特异性受体的已知肽结合物，血液中蛋白酶介导的降解的易感性，以及需要一种强大的靶向策略来靶向血脑屏障并指导患病细胞。本节概述了设计脑靶向肽功能化NPs的关键方法。它首先讨论噬菌体展示，一种识别新的血脑屏障靶向和疾病归巢肽的技术。我们讨论了靶向多个受体的融合肽的独特特性，实现了级联的血脑屏障交叉和疾病特异性靶向策略。然后讨论强调了环肽的潜力，它提供了更高的稳定性和结合特异性。最后，对肽设计的其他考虑进行了回顾，包括修改以提高稳定性，靶向效率和与NP平台的兼容性。这些策略体现了肽工程在克服脑药物输送障碍方面的进展和前景（图3）。
图3 用于纳米颗粒（NP）功能化的新型脑靶向肽的新发现和验证管道。首先，使用噬菌体展示或生成式深度学习模型来发现与血脑屏障上的目标受体具有高亲和力的肽。候选肽被合成并偶联到np上。最后，在体外和体内验证了肽功能化的NPs可以通过血脑屏障传递
噬菌体展示
噬菌体展示是一种工具，能够筛选多达 10^9 种肽序列的文库，以识别能特异性结合脑内皮细胞（BCECs）或大脑疾病特异性区域的新型肽。将肽库与噬菌体表面的衣壳蛋白融合，每种肽都展示在独特的噬菌体表面，并在原位引入大脑。然后，经过灌注，仅回收与目标组织结合力强的噬菌体，并对其进行测序，以确定富集的肽，以便进一步研究。
为了识别靶向大脑的肽，Rooy 等人采用了一种两阶段的方法，即对一个由 15 个氨基酸组成的随机肽库进行筛选，以确定在灌注小鼠大脑中富集的肽，然后在体外验证富集程度最高的肽与人脑微血管内皮细胞（BCECs）的结合亲和力。还对灌注肺中的富集情况以及对非脑内皮细胞的结合亲和力进行了研究，以评估结合特异性。该技术鉴定出了两种肽，即 GLA 和 GYR，它们在小鼠静脉注射后，脑靶向性分别提高了 6 倍和 5 倍，对脑的偏好性分别比肺高 8.5 倍和 48 倍。此外，Wu 等人表明，GYR 可以通过化学修饰自组装成纳米载体，用于跨越血脑屏障递送 BACE1 siRNA，并转染神经元和小胶质细胞，在小鼠单次静脉注射后可使 BACE1 下调 50%。
曼恩等人为了识别在脑损伤部位积聚的肽，将形式为 CX7K 的环肽库注入小鼠脑损伤部位。他们发现特定序列 CAQK 在损伤区域高度富集，占回收噬菌体的 22%。将这种新型四氨基酸肽 CAQK 共轭到装载有 siRNA 的多孔硅纳米颗粒（PSiNPs）上，与对照肽 - 纳米颗粒相比，在脑损伤部位的积聚量高出 35 倍，并且在静脉注射到绿色荧光蛋白转基因小鼠体内后，实现了 70%的沉默效果。
由于噬菌体可通过巨胞饮作用穿过跨细胞膜，因此它们是识别利用巨胞饮作用渗透跨细胞血脑屏障膜的肽的有效工具。鉴于环肽具有增强的目标结合亲和力和稳定性，山口等人通过将覆盖有肽的噬菌体插入血脑屏障转孔模型中，并对噬菌体进行测序以确定膜的无血管腔侧浓度最高的肽，从 109 种肽的文库中使用噬菌体筛选来识别新型环肽。经过进一步实验，噬菌体展示期间识别出的一种新型环肽（SLS）在与脂质体结合后，在体外和小鼠静脉注射后均显示出增强的血脑屏障通透性。
融合肽
为了高效地为神经疾病递送治疗药物，众多研究都聚焦于一种双阶段靶向策略，即先用能促进穿越血脑屏障的配体对纳米颗粒进行功能化，然后再引导纳米颗粒到达与疾病相关的特定细胞类型和神经组织。这一策略促使设计出融合肽，将针对两种不同靶蛋白的肽段结合在一起，其靶向性能优于在纳米颗粒表面功能化多种不同肽段（图 2）。
郭等人将已知的能穿透血脑屏障的肽 TGN 与神经元结合肽 Tet1 通过四甘氨酸连接子连接，形成了一种新型融合肽 TPL。该融合肽在 PEG-PLA 纳米颗粒上的血脑屏障和神经元靶向能力优于单一肽修饰或双肽修饰，表明融合肽增强了其组成肽成分的协同作用机制。此外，TPL 的降解速度比单配体肽慢得多（2 小时后分别为 17%和 50%），这可能归因于其较高的等电点导致纳米颗粒与生理环境之间的排斥力更强，这表明通过融合可以调节肽的特性。在阿尔茨海默病小鼠模型中，负载荧光染料 DiR 的 TPL-NPs 在静脉注射后向脑部的递送量增加最大，其荧光强度比未靶向的纳米颗粒高 5.68 倍，比仅用 CGN 肽单靶向的纳米颗粒高 3.46 倍，比用 CGN 和 Tet1 双靶向的纳米颗粒高 1.73 倍。鉴于 CGN 比融合肽中的 TGN 具有更强的血脑屏障靶向能力，这表明 TPL 增强的血脑屏障靶向能力是融合过程中引入的独特性质所致。此外，TPL 在肝脏中的非靶向积累减少，并且神经元特异性显著提高，92.2% 的积累靠近神经元，与 CGN 功能化的纳米颗粒和 CGN 与 Tet1 双功能化的纳米颗粒相比，其积累分别高出 8.73 倍和 2.41 倍。
此外，还开发出了专门用于双重靶向血脑屏障（BTB）和神经胶质瘤细胞的融合肽。张等人将通过噬菌体展示发现的 7 个氨基酸肽 GICP（神经胶质瘤起始细胞肽）与靶向 BTB 血管内皮生长因子受体 2（VEGFR2）和神经纤毛蛋白 1（NRP-1）的 D 型 A7R 肽相结合，形成了一种新型 Y 形融合肽，能够穿过血脑屏障并靶向神经胶质瘤细胞。这种融合肽表现出增强的抗降解性，其循环时间从单个 GIPC 肽的 4 小时延长至融合 D-A7R-GIPC 肽的 12 小时。此外，与单独的 A7R 或 GIPC 相比，它们在体外对 U87MG 和 HUVEC 细胞的摄取增加，并且在携带皮下 U87MG 肿瘤的小鼠中肿瘤区域的积累增加，这可能是由于对 BTB 和神经胶质瘤细胞上互补结合受体的亲和力所致。
融合肽还为合理设计提供了多种手段，以改善治疗特性，包括连接子设计和期望的构象变化。过长的连接子长度会导致蛋白酶降解增加，而过短的连接子长度会抑制受体结合后任一肽成分所需的构象变化，因此确定融合的最佳连接子长度至关重要。郭等人通过比较无连接、二甘氨酸、四甘氨酸和六甘氨酸连接子的融合肽，证明了四甘氨酸连接子融合肽对 BCEC 和 GT1b 受体的亲和力优于其他连接子长度和单配体肽成分。连接子设计还能增强融合肽的疏水性，从而提高细胞摄取。此外，与靶受体相互作用时构象变化的程度是结合亲和力的决定因素。融合肽 TPL 与 GT1b 受体相互作用时表现出比单个肽更大的构象变化，从无规卷曲转变为α-螺旋，这表明融合能够实现与目标受体结合所需的结构构象。未来的研究应系统地探究改变连接子长度和组成对靶向特性的影响。这些研究可以包括使用 LINKER 等程序或生成式计算模型生成不同连接子的库，这些模型经过训练能够生成保持目标结合亲和力的连接子。
环肽
环肽因其良好的特性而越来越受到治疗学界的关注，这些特性包括高结合亲和力和特异性、结构稳定、膜通透性以及低降解性（图 2）。由于环状连接，环肽具有更高的结构稳定性，这限制了可能构象的数量，增加了肽处于目标结合构象的概率，并降低了在蛋白质 - 肽复合物的 X 射线结构中所见的脱靶结合构象的可能性。稳定的构象还能防止环肽与蛋白酶结合，从而降低其在血液中降解的可能性。环化还允许肽形成分子内氢键，使肽去溶剂化，从而能够穿过疏水的脂质双层。鉴于其良好的特性，已有若干研究将脑靶向环肽共轭到纳米颗粒的表面。
在用于神经治疗递送的环肽中，研究最为广泛的是 cRGD（环状精氨酸 - 甘氨酸 - 天冬氨酸），它能靶向肿瘤血管内皮细胞和胶质母细胞瘤（GBM）细胞上丰富的αvβ3 和αvβ5 整合素。Miura 等人将 cRGD 共轭聚合物胶束静脉注射到 U87MG 人 GBM 正位小鼠模型中，发现 cRGD 共轭聚合物胶束可通过整合素介导的主动运输途径增强对肿瘤血管的渗透。此外，将 cRGD 共轭到载有紫杉醇的 PEG-PLA 胶束和脂质体上，与游离药物相比，可使荷瘤小鼠的存活时间延长 10 多天，与未靶向的纳米颗粒相比延长 7 多天，当与 TR 细胞穿透肽共功能化时，存活时间进一步延长。为了克服血脑屏障（BBB）和血脑肿瘤屏障（BBTB）以治疗胶质瘤，Chen 等人将脂质体与 cRGD 和另一种靶向 BBB 的肽 Peptide-22 共功能化，结果表明在小鼠胶质瘤中的摄取量最大，与单功能化脂质体相比，存活时间延长了 3 多天。这表明同时靶向血脑屏障/血脑屏障转运体表面的低密度脂蛋白受体（LDLR）和αvβ5整合素具有协同效应。
针对神经疾病的其他脑靶向环肽也已被发现。在对 42 种肽的结合亲和力与 LRP1 的结合情况进行筛选后，坂本等人发现了一种新型环肽 KS-487，其含有环二硫键，能选择性地与血脑屏障上丰富的 LRP1 的 IV 域结合，其血脑屏障通透性高于线性肽 Angiopep-2。通过将 KS-487 与负载有治疗性肽 KS-133 的胶束或脂质体结合，KS-133 能抑制与精神分裂症有关的 VIPR2，他们表明，KS-487 靶向的纳米颗粒改善了精神分裂症小鼠模型的认知功能障碍。
环化反应可以通过多种化学反应引入线性肽中，包括常见的侧链环化（通常涉及半胱氨酸残基之间的二硫键反应）和头尾环化（在两个非相邻残基的氨基和羧酸基团之间形成酰胺键）。鉴于环肽在促进神经肽靶向递送方面的成功，未来的研究应侧重于将环化引入更广泛的现有脑靶向肽中，并将其脑靶向特性与线性肽进行比较，此外还应通过噬菌体展示或计算设计方法设计专门针对神经疾病中涉及的多种受体的新型环肽。
其他设计注意事项
通过诸如环化、主链修饰和侧链功能化等化学修饰手段来微调肽结构的能力，彻底改变了其在药物递送系统中的应用。即使是细微的结构变化，也会对肽的稳定性、靶向特异性和功能特性产生影响。在这些策略中，肽的立体异构体构型、酸可裂解连接子的引入以及肽偶联物的合理设计，已成为克服将治疗药物递送至大脑所面临挑战的变革性方法。
D 型和 L 型肽由立体异构氨基酸组成，这些氨基酸仅在α碳上的氨基位置不同（图 2）。研究表明，反向异构（RI）D 型肽比其 L 型对应物具有更高的稳定性，且不易被血液中的酶降解，同时仍保留其靶点结合亲和力。魏等人将一种 L 型肽血管紧张素（Ang）与其反向异构（RI）D 型肽异构体与胶束结合后的稳定性及血脑屏障靶向性进行了比较。尽管 RI 肽在体外对脑微血管内皮细胞（BCECs）的细胞摄取较低，但在血液中 8 小时后几乎未见降解，而 L 型肽在 2 小时内降解了 85%，从而在体内小鼠脑中总体上实现了更高的胶束分布。另一项研究表明，将来自触角蛋白的 16 氨基酸肽的 L 型 RR 和 KK 基序（对神经元蛋白酶具有高亲和力）替换为其抗降解的 D 型对应物后，其反向异构（RI）类似物在与培养的神经元孵育后浓度提高了 3.4 倍。除了提高稳定性之外，在设计融合肽时，改变靶向肽的手性也已被用作一种策略，以确保在融合后参与靶点结合的关键残基暴露在末端。
肽也可以很容易地与酸可裂解部分结合，以促进深入脑实质并减少肽之间的屏蔽作用。蔡等人设计了一种双功能化纳米颗粒，带有酸可裂解的 T7 肽和神经元靶向的 Tet1 肽，用于共递送 BACE1 siRNA 和 D 肽以治疗阿尔茨海默病。T7 促进通过转铁蛋白受体介导的内吞作用进入血脑屏障内皮细胞后，酸性环境的变化通过酸可裂解的聚乙二醇连接子使纳米颗粒从 T7 肽上脱离，释放纳米颗粒使其从受体上脱离，并从内体/溶酶体中逃逸。进入脑实质后，纳米颗粒通过 Tet1 肽靶向作用在目标神经元上积累。与单功能化纳米颗粒相比，这种递送平台显著减少了阿尔茨海默病小鼠大脑中的淀粉样斑块以及体内目标细胞中的 BACE1 基因表达。酸可裂解基团还防止了 T7 跨过血脑屏障后对 Tet1 肽的屏蔽，确保 Tet1 能够轻松地与神经元细胞上的受体靶点结合。先前的研究也使用酸可裂解连接子来靶向其他配体，例如蛋白质。用内源性转铁蛋白（Tf）蛋白修饰的金纳米颗粒（AuNPs），其连接物为酸可裂解的二氨基缩酮（DAK）连接子，在小鼠体内显示出比非可裂解的Tf-AuNPs高2.7倍的脑渗透率，这是由于在跨细胞转运进入低pH值环境后，能够使结合的AuNPs释放到脑实质中。尽管DAK在pH 7.4时非常稳定，并且很容易作为连接物引入到纳米颗粒中，但其裂解速度较慢。因此，未来的研究应侧重于设计与纳米颗粒-肽偶联具有高相容性且在跨细胞转运过程中能快速裂解的连接子。
在设计肽靶向纳米颗粒（NPs）时，必须考虑蛋白质冠（PC）如何影响靶向效果。静脉注射后，血液中的蛋白质会吸附在纳米颗粒表面，形成蛋白质冠。尽管有研究发现蛋白质冠的形成会降低靶向纳米颗粒的结合亲和力，但也有研究利用肽来控制蛋白质冠中的特定蛋白质群体，从而实现脑靶向能力。具体而言，Zhang 等人将淀粉样β蛋白（Aβ）-CN 肽共轭到纳米胶束上，这使得其能够特异性地与血液中载脂蛋白 E（ApoE）的脂质结合域结合，并通过受体结合域促进 ApoE 介导的低密度脂蛋白受体（LDLR）和低密度脂蛋白受体相关蛋白 1（LRP1）在血脑屏障（BBB）和胶质瘤细胞上的靶向。这种方法显著延长了胶质瘤荷瘤小鼠的中位生存时间，从非功能化纳米胶束的 28 天延长至功能化纳米胶束的 45 天。如果不鼓励特定蛋白质冠的形成，也可以通过调整靶向纳米颗粒的电荷、疏水性和连接子长度来减轻其形成。在胎牛血清中纳米颗粒（NPs）上蛋白质冠（PC）的形成表明，与阳离子纳米颗粒相比，阴离子纳米颗粒和疏水性纳米颗粒吸附的蛋白质种类和质量较少，这表明将具有阴离子或疏水性特征的肽进行偶联能够减少蛋白质冠的形成。此外，研究表明，将环 RGD 肽与更长的聚乙二醇（PEG）连接子偶联会增加金纳米颗粒上蛋白质的吸附。总之，未来的研究应致力于设计新型的蛋白质冠调节肽，以促进有利于脑靶向的蛋白质冠的形成，或者设计具有高度稳定构象的环肽，以防止与非靶向和内源性蛋白质的结合。
计算设计的脑靶向肽
用于从头设计蛋白质和肽的生成模型的出现，有可能加速设计具有增强特性的新型脑靶向肽。对于仅包含 20 种标准氨基酸的肽而言，所有可能的肽序列空间为 20L，其中 L 为肽序列的长度。如果考虑化学修饰和非标准氨基酸，可能的序列空间会更大。当前的理性设计策略依赖于从现有的天然结合蛋白中提取片段、编辑现有的肽结合剂以增强特定特性，或者将具有已知机制的多个肽组合起来，这将潜在的蛋白质受体靶点限制在仅具有已知肽结合剂或肽结合剂的那些上。这排除了大量没有已知肽结合剂的表面受体。
传统的肽类发现方法仍然是一个瓶颈，因为它们通常涉及筛选数十亿个随机肽序列库以寻找与目标具有高亲和力的肽。此外，对于没有已知结合剂或没有实验确定结构的蛋白质受体靶点生成库是一个随意的过程，无法缩小具有潜在特性的肽的范围以进行进一步的实验验证。生成式深度学习模型通过学习大量实验验证肽数据库中的关键基序，能够有效地在类似于化学上可行的肽的子空间内采样多样化的序列（图 3）。
新肽发现的生成模型
生成蛋白质和肽的设计可以根据模型训练时所生成的表示类型大致分为基于序列的模型和基于结构的模型。基于序列的模型仅在大型数据库中肽的序列表示（如氨基酸或简化分子线性输入规范（SMILES）字符串）上进行训练，其中每个序列都被分割成标记，这些标记充当所有肽序列的词汇表。由于肽的结构构象和化学性质在很大程度上由其独特的氨基酸序列决定，基于序列的模型被训练以有效地在数值特征嵌入中捕获这些多样的性质，其中嵌入是一个向量，它捕获了每个标记的独特性质。这些嵌入捕获了肽的局部和全局特征——包括疏水性、电荷、键合相互作用和 pH 值——以及每个标记在数据库中出现的上下文。然后，这些嵌入被用于从头设计肽，方法是训练一个生成模型，该模型从可行组合的学习分布中生成新的肽标记嵌入组合，并将其解码为相应的氨基酸或 SMILES 序列。尽管已经探索了用于建模序列的各种架构，但最有前景的是基于 Transformer 的模型，它从序列中每个标记的全局肽上下文的特征嵌入中取加权和，以捕获残基之间的长程关系。ESM（进化规模建模）是一组基于 Transformer 的模型，它们在来自 UniProt 蛋白质数据库的 6500 万个氨基酸序列上进行训练。ESM 通过在训练序列中掩码一部分标记，并最小化从参数化特征嵌入重建原始序列的误差来进行训练，这样最终模型就能够从未见过的蛋白质序列中生成嵌入，从而捕捉蛋白质的结构和特性。预训练的 ESM 主干网络已被用于各种肽设计和发现的生成模型中，特别是用于从一系列未知掩码标记中学习重建肽序列的掩码扩散模型。
基于结构的模型以肽的二级结构或肽 - 蛋白质构象为训练数据，生成新的肽结构，这些结构可进一步解码为用于合成的序列。这些模型明确地以肽结构为训练对象，因此能够根据特定的结构约束（例如目标蛋白质结合位点）生成肽。然而，基于结构的模型的一个主要局限性在于，从结构表示到序列表示的有效转换难以准确地形成生成的结构。为了解决这个问题，开发了一类称为逆折叠模型的深度学习模型，它们能够从三维表示中预测蛋白质或肽的序列。由于肽的序列长度比用于训练逆折叠模型的蛋白质短，并且通常只形成二级结构而非像蛋白质那样的三级结构，因此肽的结构数据较为稀疏，从结构到序列的转换可能会产生不具有所需特性的序列。因此，基于序列的模型比基于结构的模型更适合用于肽的生成设计，因为它们能够从更大的数据集中捕捉肽序列的内在特性，同时避免了从序列到结构转换过程中引入的不准确性。
目的：发现血脑屏障靶向肽
生成肽发现的一个最常见目标是靶标感知生成，即生成过程以结合基序或靶蛋白完整序列的结构或序列为条件。靶标感知模型在已知结合亲和力或结构的肽 - 蛋白质对上进行训练，以学习决定结合的不同特征，例如疏水性、共价和非共价相互作用、结构互补性等。这使得模型能够根据蛋白质靶标中的氨基酸生成具有高结合亲和力的新型肽结合剂，即使该特定蛋白质未经过训练。靶标感知模型还可根据靶蛋白的输入表示分为基于序列的或基于结构的。基于目标序列的模型从 UniProt 等数据库获取蛋白质靶点或结合基序的氨基酸序列，将该序列转换为富含特征的嵌入序列，并根据蛋白质嵌入所代表的化学性质和结构特征生成具有高亲和力的互补肽结合剂序列。基于目标结构的模型利用目标蛋白质的三维结构或特定结合口袋生成与目标结构互补的新肽序列或结构。对于具有已知结构的受体，蛋白质结构可以从蛋白质数据库（PDB）等资源中获取。如果受体结构不可用，替代方法包括利用基于序列的生成模型或使用结构预测工具来推断受体的构象。虽然这两种方法都能根据目标结合亲和力进行条件设置，但基于序列的方法通过仅依赖氨基酸特征嵌入中固有的特征和上下文，将潜在目标的空间扩展到了那些没有经过实验验证或稳定三级结构的蛋白质。
基于属性的设计是一种替代目标，能够实现针对血脑屏障（BBB）靶向肽的设计。这种方法不是基于特定的靶蛋白或受体进行条件设定，而是设定生成具有特定属性（如血脑屏障通透性）的肽。这些模型利用分类模型，给定肽序列，能够预测一个分数，该分数决定了序列在给定目标中的表现。分类模型通过有标签的实验数据进行训练，以学习区分具有给定属性的序列和不具有该属性的序列的特征。已经开发了多种机器学习模型来预测分子穿过血脑屏障的通透性。将这些分类器与基于分数的生成模型相结合，可以奖励得分高的肽，并引导模型生成具有增强属性的肽。该框架已通过强化学习和多属性条件化血脑屏障靶向肽生成来探索用于发现可透过血脑屏障的小分子药物，其中肽不仅以靶点结合亲和力为条件，还以膜通透性为条件，从而实现具有细胞内作用机制的疗法的细胞转染、提高药物负载的溶解性以及减少脱靶效应的溶血性和非污染性，使用一组在标记肽数据集上训练的属性分类器。
结论
肽类物质已作为一类靶向配体出现，用于增强治疗药物的递送，具有合成简便、分子量小、成本低以及免疫原性低等优点，优于蛋白质和抗体等其他类型的配体。与此同时，用于静脉给药的各种药物的纳米颗粒（NP）递送载体的合理设计也展现出巨大潜力。特别是下一代核酸治疗药物尤其需要纳米颗粒封装，例如最近获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的用于治疗多发性神经病的 siRNA 疗法 Onpattro 以及 mRNA 新冠疫苗，它们均被脂质纳米颗粒（LNPs）封装。尽管静脉给药的药物进入大脑存在生物屏障，但将靶向特异性肽连接到优化的纳米颗粒系统上已被证明能协同促进低细胞毒性、低降解性、血脑屏障靶向以及多种药物负载的细胞摄取，适用于包括胶质瘤、阿尔茨海默病、帕金森病、中风等多种神经系统疾病。具体而言，RVG29、T7、Angiopep-2 和 mApoE 肽，这些肽能靶向在血脑屏障和脑细胞类型中广泛表达的 nAchR、TfR 和 LDL 受体，在神经疾病模型中已展现出良好前景。由于在神经胶质瘤细胞上 TfR 和 LDL 受体的上调以及在神经元上 nAchR 的存在，这些肽还具有多重靶向功能。已开发出涉及这些成熟肽的合理设计策略，以增强其脑靶向特性，包括多靶点结合肽的融合、环化以及与细胞穿透肽的协同功能化。
由于理性设计策略将肽功能化纳米颗粒的潜在靶点限制在仅具有已知肽结合剂的那些靶点上，因此迫切需要从头发现新的肽。为此，必须利用噬菌体展示等传统技术以及生成式深度学习等新兴进展来拓宽治疗途径，尤其要专注于实现脑特异性以及向参与神经疾病的细胞归巢。
尽管脑靶向纳米颗粒取得了重大进展，但要将这些平台应用于临床仍面临诸多挑战。特别是要确保靶向肽满足治疗可行性的各种属性，包括半衰期、抗吸附性和无溶血性，这对于后期临床阶段的成功至关重要。这需要通过体外和体内实验严格验证候选肽的属性，借助计算属性预测器缩小候选范围可加快这一过程。此外，脑靶向纳米颗粒的开发流程要实现规模化，还需要进一步优化高通量肽合成、偶联和纯化方法。
通过这篇综述中所描述的工作，我们证明了通过弥合计算设计策略的进步与实验研究之间的差距，我们能够设计并发现有效的肽结合剂，以克服向大脑有效输送药物的最大障碍，最终促进下一代针对中枢神经系统的精准治疗药物的发展。
参考文献：doi.org/10.1007/s13346-025-01840-w
