影响 CPP 摄取的因素有多个，但大致可分为三个部分，即（i）物理化学因素，（ii）细胞类型以及相互作用的膜类型，（iii）实验条件，如图1所示。
图1 影响细胞内吞穿膜肽（CPPs）的主要因素示意图。
考虑到所讨论的内化机制，我们完全可以理解CPPs的理化特性对其摄取过程有多么关键。其中最重要的是电荷。带有精氨酸和赖氨酸等阳离子残基的肽往往与带负电荷的膜有更强的相互作用，从而实现更高的内化率。然而，精氨酸残基比赖氨酸残基更受青睐，因为除了正常的静电相互作用外，其胍基的存在还使其能够形成双齿氢键。除此之外，两亲性也是CPP摄取过程中的关键因素。相互作用肽的两亲性决定了它们与细胞膜的亲水和疏水相互作用。这些相互作用使CPPs能够通过桶-棒模型或环孔模型形成孔隙而穿过膜，这取决于它们的两亲性。
此外，观察到通常被认为是两亲性不强的肽一般通过胞吞作用实现内化。此外，与肽相连或复合的货物在决定内吞作用方面也起着至关重要的作用。Maiolo等人发表的一份报告表明，货物确实会影响R7和R7W（用色氨酸修饰的R7）的内吞作用。未连接货物的肽显示出弥散信号，表明直接转运，而连接货物的肽显示出较低的弥散信号，并且内吞小泡的点状信号增加。这表明当肽与货物连接时，内吞作用是通过内吞作用发生的。同样，在TAT与小肽和球状蛋白连接的情况下，观察到TAT-肽共轭物呈弥散分布，而TAT与较大的球状蛋白连接时则位于小泡中。因此，这证实了货物的大小在决定内吞途径方面至关重要。因此，与CPPs连接的货物越大，通过内吞作用内化的可能性就越高，货物越小，直接转运的可能性就越高。
另一个影响摄取的重要因素是细胞类型以及细胞膜的类型。为了探究这一方面，穆勒等人评估了 22 种细胞穿透肽（CPPs）在 Cos-7、HEK293、HeLa 和 MDCK 细胞中的摄取情况，例如 Pep-1、穿透肽、TAT、转运肽、MPG、R7 和 R9。通过他们的研究，他们能够将 CPPs 分为高穿透肽（穿透肽、转运肽和 MAP）、中等穿透肽（TAT、Pep-1 和 MPG）和低穿透肽。然而，他们观察到肽表现出细胞特异性的内化效率。例如，MPG 在 Cos-7（成纤维细胞）细胞中表现出更高的内化效率，穿透肽在 HeLa 细胞中表现出优先内化，而转运肽在所有细胞系中表现出相似的效率。此外，TAT 在 HeLa 和 MDCK 细胞中显示出弥散的细胞质信号和核定位，而在 Cos-7 和 HEK293 细胞中则显示出内吞摄取。此外，阳离子聚合物（CPPs）与细胞外基质中的阴离子糖胺聚糖（如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖）的相互作用也有助于其内化。然而，此类蛋白聚糖在细胞表面的表达取决于细胞的生长阶段和分化状态。而且，不同细胞中观察到的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的特定异构体表达也存在差异。这使得其内化效率因所接触的细胞类型而异。
Pep-1：KETWWETWWTEWSQPKKKRKV
穿透肽(Penetratin)：RQIKIWFQNRRMKWKK
TAT：YGRKKRRQRRR
转运肽(Transportan)：GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL
MAP：KLALKLALKALKAALKLA
MPG：GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV
值得一提的是，像TAT、R8和R9这样的几种肽已显示出与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）相互作用以实现内化。除了与细胞外HSPG的相互作用外，膜特性也是决定细胞穿透肽（CPPs）跨膜转运的一个主要因素。例如，在使用不同流体和刚性膜评估赖氨酸和半胱氨酸修饰的非精氨酸肽的摄取时，观察到了效率上的差异。发现这些肽与带负电荷的膜相互作用，并且由于电荷中和、降低表面压力和超分子变形，能够穿过含有DOPG/DPPC（饱和脂质膜）和DOPG/DOPC（不饱和脂质膜）的膜。然而，当暴露于含有胆固醇（起流动性缓冲作用）的单分子层时，其跨膜转运受到阻碍。因此，可以得出结论，膜中胆固醇的存在会阻碍多聚精氨酸的跨膜转运。
除了上述因素外，实验因素在细胞穿透肽（CPPs）的内化过程中也起着重要作用。其中最重要的因素是CPP的浓度，因为它决定了内化的机制。通常认为，在较高浓度的CPPs下，它们会直接穿透，而在较低浓度下，它们通过内吞作用内化。例如，在较低浓度下评估R8时，观察到细胞内的囊泡定位，而在较高浓度下，观察到囊泡和扩散标记，这表明内吞作用和直接穿透同时发生。在TAT和R9的情况下也可以观察到类似的结果。然而，穿透素似乎不受此规则的限制，在低浓度下表现出直接穿透，在高浓度下表现出内吞作用。实验进行的温度也是一个关键因素。同样，在4°C下评估荧光标记的R8的转运时，观察到扩散信号。然而，在37°C下评估时，观察到扩散和囊泡信号，这表明内化是通过内吞作用进行的。此外，肽与细胞的比例是影响内化作用的另一个关键因素。为了探究这一方面，Hällbrink等人通过调整体积并保持CPP的浓度和细胞数量不变，评估了CPP在CHO细胞中的内化情况。结果发现，通过增加体积并保持CPP浓度不变，内化作用得以增强。实际上，这种内化作用高于浓度增加时的内化作用，因为稀释使肽得以定向并接触到细胞膜以实现相互作用和内化。此外，在恒定浓度下用不同密度的细胞进行处理表明，随着细胞密度的增加，内化作用降低。这可能是由于细胞融合度增加导致接触细胞膜的机会减少。因此，这表明实验因素在CPP内化中也起着重要作用，在研究中应予以仔细考虑。因此，了解可能影响CPP内化的因素有助于设计适用于所需应用的CPP。要了解CPP设计方面的内容，建议读者参阅所引用的文献。
参考文献：doi.org/10.1039/D0BM01755H
