ADC连接子分为可切割型与不可切割型两类。根据切割机制，可切割型连接子又可细分为化学切割型与酶切型(图 3)。连接子的长度、极性与稳定性对ADC的治疗效果至关重要。连接子的设计通常取决于ADC的用途及作用方式。已有多篇综述总结了不同类型的连接子，因此当前部分主要聚焦于肽连接子，即一类重要的酶切型连接子。作者概述了组织蛋白酶可切割的二肽、三肽与四肽连接子，并重点介绍利用其他酶类作为释放机制的肽连接子开发进展，以及通过连接子修饰提升ADC治疗效果的策略。

1 酶切型肽连接子：从前药到ADCs

高效ADC需要在循环中保持载荷−连接子复合物的稳定性，同时在肿瘤细胞内高效释放药物。ADCs通常被转运至肿瘤细胞溶酶体，在此高浓度的水解酶或蛋白酶选择性切割肽连接子，释放载荷。早期的研究主要集中于蒽环类前药，如将阿糖胞苷(DNR)或阿霉素(DOX)与二肽偶联。Ala−Leu−DNR在肿瘤细胞内被激活并水解为DNR。为提升稳定性与切割效率，研究者设计了自裂解型对氨基苄基氨基甲酸酯(PABC)间隔子，并证实其对蛋白酶激活前药设计至关重要。若缺乏PABC间隔子，cathepsin B无法切割前药并释放DOX，ADC也随之失效。

Cathepsin B是一种溶酶体蛋白酶，属于木瓜蛋白酶家族，在大多数肿瘤中过度表达，其活性受限于酸性环境(pH3.5−6.0)，而在正常细胞外环境几乎不表达，仅在病理条件(如转移瘤)下出现。因此，基于cathepsin B可切割的肽连接子通常在循环中保持稳定。研究表明，含Phe−Lys−PABC−DOX或Val−Lys−PABC−DOX的前药可被cathepsin B高效切割，释放自由DOX，并在血浆中保持稳定。Arg虽被测试作为替代氨基酸，但表现不如Lys；而与Arg同构的瓜氨酸(Cit)在Val−Cit−PABC−DOX中则展现出良好的血浆稳定性。不同肽基对DOX释放速率存在差异，例如Z-Phe−Lys−PABC−DOX的释放速率比Z-Val−Cit−PABC−DOX快30倍，但在大鼠肝溶酶体中两者速率相同。比较来看，Val−Cit连接子在血浆稳定性优于Phe−Lys连接子，两者均显示出显著抗肿瘤活性。

目前，Val−Cit连接子是研究最为广泛的溶酶体可切割二肽连接子，已用于6种FDA批准药物中。另一类Val−Ala连接子也被证实为有效的蛋白酶可切割基团，并已用于批准药物loncastuximab tesirine (表 2)。在cathepsin B体外实验中，Val−Ala的切割速率约为Val−Cit的一半，但其疏水性较低，且具有更高的药物−抗体比(DAR)，并能减少ADC聚集。进一步比较显示，带有Val−Ala连接子的ADC抗肿瘤活性优于Val−Cit、Val−Lys与Val−Arg类似物。近期，Val−Gln连接子在细胞裂解液与cathepsin中切割速度更快，且含有Val−Gln的ADC展现出强效抗肿瘤活性(表 2)。这些结果均表明，酶切型肽连接子是ADC药物中的关键组成。

图2 (A) 传统ADC作用机制：ADC的抗体与癌细胞表面受体结合，形成ADC−抗原复合物，并通过受体介导的内吞作用进入细胞。随后，ADC从内体转运至溶酶体，在此降解释放载荷至细胞质中。游离载荷通过与微管、线粒体或细胞核内DNA相互作用来杀伤肿瘤细胞。一部分载荷还可扩散至邻近肿瘤细胞，产生旁观者效应。(B) Val−Cit二肽连接子的化学结构。(C) Gly−Gly−Phe−Gly四肽连接子的化学结构，均以青色标注。

2 Val−Cit与Val−Ala二肽连接子的缺陷

尽管Val−Cit或Val−Ala二肽连接子在人体血浆中稳定，且能在靶细胞溶酶体中高效释放药物，但仍存在一些局限：

• • 在啮齿类动物中不稳定：因其易受啮齿类血浆中胞外丝氨酸水解酶carboxylesterase 1C(Ces1C)降解，从而导致药物过早释放，影响临床前安全性与疗效研究的准确性。
• • 人源中性粒细胞弹性蛋白酶的影响：该酶可水解Val−Cit连接子，导致骨髓中分化中性粒细胞分泌的丝氨酸蛋白酶介导的胞外切割，从而引发中性粒细胞减少症。
• • 疏水性诱导聚集：Val−Cit或其他二肽连接子通常需要PABC间隔子，而其疏水性与Val−Cit自身疏水性叠加，容易诱导ADC聚集。研究发现，亲水性葡萄糖醛酸连接子可稳定形成单体ADC，而Val−Cit连接子则易导致ADC聚集。此外，连接子与载荷增加抗体表面疏水性，进一步促进聚集并增强非特异性蛋白相互作用，进而提高脱靶毒性风险。

虽然通过降低DAR可缓解疏水性带来的负面影响，但对于低表达靶点或中等效力载荷而言，该方法并不适用。鉴于Val−Cit与Val−Ala连接子的局限性，研究者已开发出多种新型cathepsin可切割肽连接子来克服这些问题(表 2)。

表1 | 全球已上市的ADC及其特征

3 新型可被Cathepsin切割的肽连接子

带有Glu−Val−Cit连接子的ADC表现出良好的酶切药物释放效果，并且在小鼠体内几乎不发生过早切割。另一种采用喜树碱衍生物作为载荷、通过新型亲水性cathepsin可切割的Val−Lys−Gly三肽连接子偶联的ADC，在实体瘤与血液肿瘤的临床前研究中均展现出广谱治疗活性。Glu−Gly−Cit连接子在小鼠和灵长类模型中保持长期稳定性，并能抵抗中性粒细胞蛋白酶介导的降解，含有该连接子的ADC在乳腺癌治疗中表现出更佳的疗效与安全性。使用Val−Ala−Gly三肽连接子的ADC抗肿瘤活性优于已批准的Kadcyla。该连接子虽不含PABC自裂解基团，但能在靶细胞溶酶体内切割释放药物。

Gly−Gly−Phe−Gly四肽连接子最早在DOX与羧甲基普鲁兰结合物中被发现，表现出优于无连接子的偶联物的抗肿瘤效果。后续研究证明，该四肽连接子的药物释放依赖于肿瘤中cathepsin的表达。新型ADC DS-8201a (T-Dxd, trastuzumab deruxtecan)，采用此类连接子，对高或低HER2表达的T-DM1耐药乳腺癌患者均有效。另一种TROP2靶向ADC Datroway (datopotamab deruxtecan) 也含有该四肽连接子，已被批准用于治疗不可切除或转移性乳腺癌患者。这些结果表明，三肽或四肽连接子是一种提升ADC稳定性与安全性的有效策略。

图3 | ADC连接子的化学结构与特征。 不可切割连接子主要包括MCC(马来酰亚甲基环己烷-1-羧酸酯)和MC(马来酰己酰)硫醚连接子。可切割连接子则可被酸性环境(如内体与溶酶体)、还原性分子(如谷胱甘肽)或酶切割。

表2 | 含肽连接子的酶激活型ADC

4 利用其他酶切型肽连接子

目前多数已上市ADC采用cathepsin可切割肽连接子。然而，研究发现这些连接子也可能被外源酶(如Ces1C和中性粒细胞弹性蛋白酶)切割，从而导致脱靶毒性。人类基因组中已鉴定出600余种蛋白酶，其中许多与肿瘤增殖、侵袭和转移密切相关。因此，研究者开发了基于其他酶类(如legumain、纤溶酶PLM和成纤维细胞活化蛋白FAP)的肽连接子，以减少非特异性药物释放(表 2)。

• • Legumain连接子：Legumain是一种半胱氨酸内肽酶，在大多数人类实体瘤中过表达，并与预后不良和晚期病程相关。其特异性要求底物在P1位带有Asn。基于Ala−Ala−Asn−Leu四肽或Ala−Ala−Asn三肽的legumain激活前药已被设计，并在多种肿瘤中展现有效抗癌活性。将Val−Cit连接子与Ala−Ala−Asn连接子结合的ADC显示出强效抗肿瘤活性。含有Asn−Asn二肽连接子的MMAE-ADC具有与Val−Cit ADC相当的强效和选择性，并且对中性粒细胞弹性蛋白酶完全稳定，在小鼠和人血清中也表现出优异稳定性，凸显了legumain切割型连接子的巨大潜力。
• • 纤溶酶(PLM)连接子：PLM在肿瘤侵袭与转移中发挥重要作用。研究合成并测试了一系列三肽酰胺作为底物，其中Ala−Ala−Lys三肽是PLM的特异且稳定底物。基于D-Val−Leu−Lys的前药对癌细胞的选择性比游离药物提高5倍。进一步开发的DOX和PTX前药(如D-ala−Phe−Lys−PABC−DOX、D-val−Leu−Lys−PABC−PTX)展现出优异抗癌活性和更快的PLM激活速率。一种带有Val−Leu−Lys连接子与MMAE载荷的ADC在抑制肿瘤生长方面显著优于对照组。
• • FAP连接子：FAP是一种丝氨酸蛋白酶家族的细胞表面糖蛋白，由癌相关成纤维细胞在90%以上的上皮癌中高表达，而在正常成纤维细胞及其他正常组织中几乎不表达，因此是极具潜力的治疗靶点。FAP的底物特征为严格的Gly−Pro切割特异性。含有Gly−Pro连接子的ADC可在肿瘤部位选择性释放药物，在临床前模型中展现出良好抗肿瘤效果。此外，FAP切割的Gly−Pro二肽连接子在多种SMDCs中也表现出快速而特异的肿瘤微环境切割。

图4 | 代表性ADC连接子的化学结构 ，含有亲水性基团的修饰：PEG(a−c)、环糊精(d)与pSAR(e)，青色背景部分为高亮。

参考文献：doi.org/10.1021/acs.jmedchem.5c01500