1. 基于肿瘤酸性微环境的策略
1.1. 智能连接体
众所周知，肿瘤微环境相对呈酸性。因此，可以开发 pH 敏感型连接体以实现有效载荷的选择性释放（表 2）。由于腙键在中性环境中稳定但在弱酸性条件下容易水解，所以它是应用最广泛的 pH 敏感型连接体。除了腙键，亚胺键、肟键、缩醛键或顺乌头酸键也被使用。Backer 等人构建了两代磷酰胺骨架，其可根据酸性基团的临近程度和临近酸性基团的 pKa 值在不同 pH 值下触发释放货物。Roberts 等人在制备一种特殊连接体时引入了 1，4-三唑环，其在消除序列中表现出 pH 敏感型中间体。Zhang 等人通过断裂酰胺键合成了 pH 敏感型连接体。
表 2. 基于肿瘤酸性微环境的智能连接子
1.2. 肽电荷转换策略
提出了一种由肿瘤酸性激活的电荷转换策略系统，用于靶向药物递送。使用了具有YGRKRRQRRC序列的ACPP，其正电荷通过pH敏感连接子与琥珀酰氯锁定，以防止细胞穿透。一旦到达目标肿瘤组织或细胞，由于酸诱导的电荷转换，CPP的细胞穿透功能被激活。
张等人提出了一种ACPP（CR8G3PK6）以实现靶向药物递送（图3）。他们通过与2,3-二甲基马来酸酐（DMA）连接修饰K6残基中的伯胺，将其酰胺化并降低ζ电位。在生理pH值下，由于分子内静电吸引，ACPP失活，防止CPP与细胞相互作用。在酸性肿瘤微环境中，DMA迅速水解，诱导电荷反转，进一步通过静电排斥激活CPP的主要功能，从而实现肿瘤细胞的快速细胞摄取。体内研究表明，用DOX-ACPP-DMA治疗后，14天时肿瘤异种移植体积降至50立方毫米（对照组则接近2000立方毫米），这表明DOX-ACPP-DMA显著抑制了肿瘤生长。
图 3. 通过 DMA 静电吸引暂时锁定 R8 的细胞穿透功能。在低 pH 值条件下，DMA 水解激活 CPP 的细胞穿透能力，并提高肿瘤细胞对 CPP 的摄取效率。
在另一项研究中，张等人制备了pH响应型α-螺旋TTP（TH-Lip）修饰的紫杉醇（PTX）载脂质体（图4）。当修饰后的脂质体进入肿瘤微环境时，由于pH值较低，TH-Lip肽中的组氨酸被质子化，使TH-Lip的表面电荷从负变为正，从而启动肿瘤渗透和吸收。然后将TH-Lip用于紫杉醇（PTX）向肿瘤部位的靶向递送，体内和体外结果表明，它极大地增强了PTX对肿瘤生长的抑制作用。在C26荷瘤小鼠中，负载PTX的TH-Lip的抑制率为86.3%。
图 4. TH-Lip 药物递送机制示意图。在低 pH 值条件下，TH-Lip 肽中的组氨酸被质子化，TH-Lip 的电荷发生变化，启动肿瘤浸润激活并加速肿瘤吸收。
pH（低）插入肽（pHLIP肽）是一类对膜pH值敏感的肽，能够将药物递送至癌细胞。在正常pH值条件下，pHLIP可以与细胞膜结合。一旦进入肿瘤，pH值降低会使天冬氨酸和谷氨酸残基质子化，增强其与膜的亲和力，从而导致膜折叠并形成跨膜螺旋，同时释放能量（图5）。阿多奇特等人将不同的pHLIP变体与不同的荧光染料结合，获得了三种荧光标记的pHLIP肽，即WT、Var3和Var7（表3）。实验结果表明，不同货物与pHLIP的偶联可以改变生物分布并提高肿瘤靶向性。此外，维拉科迪等人首次设计了一种新型的pH敏感型带负电荷的肽（pH[低]插入循环，或pHLIC），他们发现c[E4W5C]在体内表现出良好的肿瘤靶向性，并建立了最高的肿瘤靶向肌肉比（5.6）。在此基础上，亨利等人通过将c[E4W5C]与双功能马来酰亚胺-NO2A偶联并用64Cu标记，设计了一种新型的pH敏感型探针，即[64Cu]Cu-c[E4W5C]pHLIC。体内研究表明，这种pH敏感探针在小鼠酸中毒区域的摄取显著增加，这为无创评估中枢和外周酸中毒提供了一个有价值的工具。
表 3. 对肿瘤酸性微环境敏感的肽类物质
图 5. pHLIP 肽膜穿透示意图。当 pH 值降低时，pHLIP 肽中的天冬氨酸和谷氨酸被质子化，从而引发膜折叠并形成跨膜螺旋。
2. 基于肿瘤缺氧微环境的策略
2.1. 智能连接子
针对肿瘤的低氧微环境，也开发了相应的连接子用于靶向药物递送。谷胱甘肽（GSH）是细胞质中的一种抗氧化剂，其在癌细胞中的浓度远高于正常细胞。因此，可在谷胱甘肽作用下断裂的二硫键或硫酯键可用于肿瘤靶向治疗（表4）。通过将含半胱氨酸的肽与含硫醇的毒性药物或前药反应，这些键可轻松整合到肽-药物偶联物（PDC）中。当这些PDC遇到癌细胞中较高浓度的谷胱甘肽时，二硫键断裂释放抗肿瘤药物并发挥抗肿瘤作用。最近，硫酯衍生物也被研究作为可裂解的连接子结构。
表 4. 基于肿瘤缺氧微环境的智能连接子
2.2. 肽构象变化策略
活性氧（ROS）是重要的细胞内和细胞外信号分子。在肿瘤微环境中，缺氧刺激线粒体持续产生活性氧，导致癌细胞中的活性氧水平高于正常组织。因此，开发了一种由肿瘤组织中过度活跃的活性氧触发的药物递送策略。半胱氨酸氧化引起的非共价相互作用的波动可诱导蛋白质三级和四级结构的变化，这可用于设计氧化还原刺激肽。具体而言，肽PEG-PCys-Chol（聚乙二醇-聚C-胆固醇）在溶液中采用β-折叠构象并组装成胶束。（96）经活性氧处理后，聚C被氧化，生成的PEG-PCys-Chol-O2采用α-螺旋构象，从胶束转变为囊泡（图6）。生成的囊泡表现出将阿霉素（DOX）递送至HeLa细胞的强大能力。最终，DOX@PEG-PCys-Chol-O2对肿瘤细胞的抑制活性显著提高，其IC50（0.66μg·mL-1）比未氧化的低5倍。这一结果与它较高的内化能力相一致，而这种能力是由于含胆固醇的α-螺旋结构所致。
图 6. 高活性氧条件下肽的反应示意图。氧化型 PEG-PCYs-Chol 采取了α-螺旋构象，并表现出从胶束到囊泡的结构转变，促进了细胞膜的穿透。
3. 基于肿瘤相关酶的策略与肽类物质
3.1. 智能连接体
利用可被酶切割的结构是开发裂解连接体的另一种方法。例如，酯和氨基甲酸酯均可被酯酶和细胞色素P450水解，或在溶酶体的pH值条件下水解。然而，它们在血清中不稳定，因此在肽合成过程中应特别注意其稳定性。此外，梅迪纳的研究小组合成了一类芳香族偶氮连接体，这类连接体可被偶氮还原酶选择性识别和裂解，偶氮还原酶是肝细胞癌细胞胞质中常见的酶。与上述两种连接体相比，这种连接体的特异性得到了提高。
最近，硫醚连接子也得到了更好的应用，Ziaei 等人合成了含硫醚的 PDC。目标肽通过琥珀酰亚胺硫醚键与连接子偶联，进一步与阿霉素（Dox）结合。与上述连接子相比，这种连接子的靶向切割效果进一步提高。它能在溶酶体中被切割，释放阿霉素。该偶联物对三阴性乳腺癌（TNBC）细胞具有高度细胞毒性，而对非癌性 MCF-10A 乳腺细胞的细胞毒性较低。因此，这种可酶切的连接子是利用肿瘤细胞中有效载荷的可控释放的理想结构。
碱性磷酸酶（ALP）是一种在干细胞和某些癌细胞中过度表达的酶，它有助于实体瘤中的免疫抑制，但它是“不可成药”的。Feng等人报道了一种酶导向肽（Nap-ffypeMe2(1P)），它能选择性抑制过度表达ALP的肿瘤（表5）。当设计的肽到达肿瘤组织时，ALP会从前体中切割磷酸盐，并触发所得肽的自组装。在碱性磷酸酶过表达的Saos-2细胞中选择性形成的肽组装体诱导了癌细胞死亡，有效抑制了原位骨肉瘤模型中的肿瘤生长，且对正常器官无毒性。
表 5. 基于肿瘤相关酶的智能连接子
3.2. 肽序列
除了上述提到的化学键断裂方法外，短氨基酸序列作为连接子也备受关注，因为它们能被肿瘤组织中过表达的蛋白酶清晰识别。例如，V-Cit和GFLG连接子可被溶酶体蛋白酶组织蛋白酶B切割，从而从抗体药物偶联物（ADCs）或肽药物中释放治疗药物，它们与抗体或放射性标记的神经肽结合可提高肿瘤的靶向治疗效果。
莱古米恩是一种哺乳动物蛋白酶，在肿瘤微环境（TME）的细胞间质中以高浓度存在。因此，它可用于实现药物在预期靶细胞中的特异性激活，从而提高药物治疗的特异性。莱古米恩能特异性切割氨基酸序列Ala-Ala-Asn。如果货物通过这种连接子与载体连接，那么在Asn被切割后，识别序列被切断，所附载荷就能无缝释放。
此外，一些长肽序列也能被特定酶识别，发挥药物靶向作用。刘等人设计了树状大分子，主要由细胞毒性肽KLAK、细胞穿透肽TAT和基质金属蛋白酶2（MMP2）敏感肽通过聚乙二醇（PEG）连接而成。MMP2敏感肽（GPLGIAGQ）用于去除脂质体载体上的PEG屏蔽，促进其细胞内化。结果表明，小树状大分子能深入肿瘤组织，有效进入细胞并破坏线粒体膜，诱导细胞凋亡。该策略改善了细胞穿透肽（CPPs）存在的非靶向分布、半衰期短和生物利用度低等缺点。
甘地等人设计了一种酶敏感肽序列的蛋白酶检测方法。这里使用专门的肽作为纳米传感器，它们具有特定的位点可被特定蛋白酶（胰蛋白酶响应肽 GK-8 和 MMP-2 响应肽 GK-9）切割。当这些连接肽添加到生物素化功能化的氧化铁纳米颗粒（IONPs）时，纳米颗粒会聚集，导致磁性粒子光谱仪（MPS）信号发生明显变化。在蛋白酶的作用下，连接体被切断，磁性氧化铁纳米颗粒重新分散，使磁性颗粒信号恢复到其未聚集前的状态。这种磁性颗粒信号的变化有助于检测特定的蛋白酶。
许多肿瘤蛋白酶具有与CendR基序蛋白水解相容的底物特异性。Braun等人设计并合成了由尿激酶激活的TTPs，命名为uCendR（表6，其中↓表示切割位点），然后将其包被在纳米颗粒上。结果表明，uCendR可被尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）切割。在uPA过表达的乳腺肿瘤小鼠中进行全身给药后，uCendR能够使整个化合物优先靶向肿瘤组织。
表 6. 被肿瘤相关酶切割的肽序列
参考文献：doi.org/10.1021/acs.molpharmaceut.2c00629
