摘 要 本文综述了表面展示肽在无机纳米材料合成与组装中的应用。表面展示肽是利用噬菌体、细胞等表面展示技术筛选出来的一类多肽 ,可以特异性地识别不同的无机物表面。一方面它们能够诱导不同种类无机纳米材料的合成 ,有助于我们进一步认识生物矿化的过程和基本原理 ;同时表面展示肽也可以用于无机纳米材料的组装 ,构建具有特定功能的纳米结构 ,从而为纳米器件的构造提供新的途径。
蛋白质是生物体内具有重要功能的一类生物分子 ,研究蛋白质与无机物底物的表面相互作用是理解生物矿化过程的关键所在[1 —3 ] 。传统的研究方法是分离纯化生物矿化过程中起主要作用的蛋白 ,进而研究它们在体外条件下对无机矿物生长的诱导作用 ,从而从分子生物学水平上理解生物矿化过程[4 - 6 ] 。但是由于生物体系的复杂性 ,蛋白提取纯化过程中易受到所提取组织中其它蛋白的干扰 ,因此目前还无法实现对与生物矿化相关的大多数蛋白的分离和结构鉴定。随着理论计算化学的发展 ,人们可以通过理论计算模拟多肽分子和无机物表面的相互作用[7 ,8 ] 。但由于这种模拟方法中需要将无机物表面看成是理想的单晶表面 ,而在实际生物体系中无机矿化产物有可能是多晶态甚至是非晶态。近年来 ,研究者开始采用噬菌体和细胞等表面展示技术筛选与无机物有识别作用的多肽[9 ,10 ],这种表面展示肽一方面可以使我们进一步理解生物矿化过程 ,同时也为无机纳米材料的合成与组装提供了新的机遇。
2 识别无机物的表面展示肽
表面展示是一种新的基因操作技术[11 ], 它使表达的多肽以融合蛋白形式展现在噬菌体或细胞表面 , 从而使多肽保持相对独立的空间结构和生物活性 ,有利于研究多肽 (蛋白质) 的性质、相互识别和相互作用 , 并由此从展示库中筛选出特定功能的多肽 ,即表面展示肽。大量研究结果表明 ,生物分子和无机物的相互作用在生物矿化过程中扮演着重要角色 ,利用表面展示技术筛选出与无机物有特异性识别作用的多肽无疑将可以使我们更深入地了解认识生物矿化过程。
Belcher 等[9 ] 利用大约 119 ×109 个有相同氨基酸数目(7 或 12 个氨基酸) 的噬菌体 M13 的 p Ⅲ展示库与无机物作用(图 1) ,筛选了与 GaAs 有特异性识别的表面展示肽。首先 ,将噬菌体的随机肽库在Tris 缓冲溶液中与无机物混合 ,使在 p Ⅲ展示中的多肽能够与无机物表面发生作用。经过一段时间之后 ,与无机物表面有相互作用的多肽噬菌体被吸附在无机物表面 ;再用不同pH 值的 Tris 缓冲溶液洗脱有相互作用的多肽噬菌体。对洗脱下来的噬菌体进行扩增 ,将得到的扩增体系即新的“噬菌体肽库”再与无机物作用。最后 ,经过 3 —5 轮的“吸附2洗脱2扩增”过程 ,便可得到含有一种或几种多肽肽序的“噬菌体肽库”。分析这个肽库中噬菌体的 p Ⅲ蛋白的编码基因 ,可以得到与无机物有特异性识别作用的多肽肽序[12 ] 。从筛选的过程可以看出表面展示肽的筛选首先要求展示肽库中必须存在能够与无机物产生特异性识别的多肽 ,因此构建出有效的展示肽库是表面展示肽筛选成功的必要前提。
研究者也尝试了利用细胞表面展示肽库[10 ] 和酵母表面展示肽库[13 ,14 ]来筛选可以识别特定无机物的多肽。通过对所得到的表面展示肽的分析发现 ,与不同无机物产生识别作用的表面展示肽中存在特殊的氨基酸序列 ,某些物质还存在有特定的识别基序(motif) ,这一结果为人们设计可与无机物产生特异性识别的多肽分子提供了重要的依据。研究证明通过表面展示技术获得的部分表面展示肽与生物体系中诱导矿化过程的蛋白质氨基酸序列相同或相似 ,为在人工条件下模拟和研究生物矿化的过程提供了一种有效的途径。表 1 给出了目前已经筛选出的对一些无机物有识别作用的表面展示肽序列。
3 表面展示肽识别无机物的机制
研究结果表明表面展示肽与无机物底物的识别包含化学[31 ] (例如偶极和电荷效应) 和物理[32 ] (例如尺寸大小和形貌匹配) 两方面机制。
Belcher 等[9 ]首先研究了含有 12 个氨基酸残基的噬菌体展示肽与 GaAs(100) 晶面的相互作用。发现随着扩增次数的增加 ,得到的表面展示肽中极性氨基酸残基的平均含量逐渐增加 ,超过了其在整个随机肽库中所占的比例 ,表明极性氨基酸残基在多肽与 GaAs (100) 晶面的相互作用中起到了主要作用。随后的研究发现 ,对于其它的半导体材料和部分磁性材料 ,如 ZnS[16 —18 ] 、CdS[16 ,18 ] 、PbS[16 ] 、FePt[18 ,19 ]和 CoPt[18 ],所筛选出的表面展示肽大部分也是由极性氨基酸残基所构成的。
对与贵金属有识别作用肽的筛选 ,首先是用细胞表面展示技术进行的。以金为例 ,筛选出的肽序是 MHGKTQATSGTIQS[20 ,21 ],分析这段肽序可以得出一个有趣的结论 :这段肽主要是由一些含有羟基的氨基酸 ,如丝氨酸(S) 、苏氨酸(T) 以及含有疏水侧链的氨基酸组成 ,而人们通常认为与金属有强相互作用的半胱氨酸(C) 、甲硫氨酸(M) 、组氨酸(H) 和色氨酸(W) 含量很低。虽然 C、M、H 和 W 含量的增加可以大大增强肽与底物的作用力[14 ],但从筛选的“吸附2洗脱2扩增”过程来看 ,强的相互作用力在增加了多肽与底物的吸附能力同时 ,也将使“洗脱”过程变得更加困难。采用噬菌体等其它的表面展示技术筛选对金有识别作用的多肽序列也得到了相同的结论 ,表明所得到的表面展示肽序列是由所使用的底物种类所决定的 ,而与采用何种表面展示技术无关。
对于 CaCO3[30 ] 来说 ,其识别多肽主要包含不带电荷的氨基酸残基或碱性氨基酸残基 ;而与其它无机物 ,例如金属氧化物[24 —26 ] 、GeO2[27 ] 、SiO2[28 ] 和沸石[27 ]等有识别作用的多肽主要由碱性氨基酸残基和含羟基氨基酸残基所构成。总的来说 ,碱性氨基酸残基在多肽与无机物表面的相互作用中起到了主要的作用。多肽中碱性氨基酸残基侧链的羟基、氨基、巯基、酰胺基等功能基团作为 Lewis 碱提供电子与无机底物中的 Lewis 酸受体作用 ,其它的氨基酸残基则主要起调节多肽的电荷和极性等作用。
表面展示肽不仅可以识别不同种类的无机纳米材料 ,而且能够区分大小、形貌或晶体结构不同的同一种类无机纳米材料。例如 ,展示肽 Z8 和 A7 就分别识别两种不同尺寸 (4 nm 和 2 nm) 的 ZnS 纳米粒子[16 ] ; GaAs ( 100) 晶面的展示肽与 GaAs ( 111) B(arsenic terminated) 晶面的作用较弱[9 ] 。
多肽的结构对其与底物的识别过程也会产生影响。展示肽中非极性氨基酸的存在不仅能调节多肽与底物相互作用力的强弱 ,而且能使多肽序列保持一定的空间构象 ,这就要求底物必须具有特定的结构才能与之匹配。Sarikaya 等[10 ,33 ] 利用分子模拟给出了金的结合肽在 Au (111) 和 (112) 表面的折叠状态 ,如图 2 所示。结合肽具有反平行的β折叠结构 ,其周期性的 OH —功能基团正好与 Au (111) 面的晶格相匹配 ,而与 Au (112) 面却不匹配。
由上可见多肽和无机底物的识别是一个复杂的过程 ,受到纳米材料的尺寸、电荷、极性和晶体结构等诸多因素的影响 ,是化学和物理两方面机制共同作用的结果。
4 表面展示肽在无机纳米材料合成中的应用
对生物矿化过程的研究表明 ,在生物矿化过程中形成了大量具有纳米结构的矿物质。通过对分离纯化的矿化蛋白的结构分析 ,人们发现 ,在同种物质的矿化蛋白中存在许多序列相同或相近的多肽基序 ,表明多肽基序在生物矿化过程中起着重要的作用。这些基序可以有效地诱导纳米材料的生成 ,是矿物质析出的成核点。表面展示肽中也存在与矿化蛋白相同或相似的基序 (motif) ,同样可以诱导无机纳米材料的合成。
Belcher 等[16 ] 用 ZnS 的 表 面 展 示 肽 Z8(LRRSSEA2HNSIV) 、A7 (NNPMHQN) 以及与 ZnS 没有识别作用的随机肽序进行了 ZnS 纳米晶的合成。结果表明 Z8 和 A7 肽都诱导了单分散的球形 ZnS 纳米粒子的生成 ,而随机肽序合成的则是无规则形态的大尺寸 ZnS 粒子 (图 3) 。电子衍射 ( ED) 分析表明 ,Z8 肽诱导合成的 ZnS 纳米晶具有闪锌矿结构 ,A7肽诱导合成的 ZnS 纳米晶具有纤维锌矿结构 ,而随机肽序得到的 ZnS 粒子是非晶结构。Stone 等[23 ] 通过改变合成过程中 Ag 的展示肽 AG4 加入量得到了球形、三角形、六边形 (图 4) 的 Ag 纳米粒子。铁磁体L 10相 FePt 的合成通常都需要高温 ,而 Belcher等[19 ]证明利用 FePt 的表面展示肽在室温下就可以得到有较高各向异性的 FePt 纳米粒子 ,并且发现展示肽中含有存在于许多生物体矿化铁磁矿物蛋白中的 motif (2KHLPST2) 。
Sarikaya 等[21 ,34 ] 用 Au 的展示肽 GBP21 (MHG2KTQATSGTIQS) 还原 AuCl3 合成 Au 纳米晶。质谱结果表明 ,每个多肽 GBP21 结合两个 Au ( Ⅲ) 离子 ,其中一个结合在序列2QAT2中 ,另一个在肽的 C 末端。由于羧酸是合成 Au 纳米晶的常用有机分子 ,因此 ,序列2QAT2很有可能是 Au 的成核位点。进一步的研究发现 ,序列2TQATS2在合成中起到了主要的作用 ,其合成的原理可能是一种酸催化机制。序列附近可作为质子给体的氨基酸残基 ,如丝氨酸 (S) 、苏氨酸(T) 、赖氨酸( K) 、谷氨酰胺(Q) 、组氨酸(H) 在还原过程中扮演了主要的角色。
我们小组[35 ]研究了 1 —4 聚赖氨酸寡肽诱导的Na2SiO3 水解行为 ,发现 1 —3 聚赖氨酸寡肽不能有效地诱导 Na2SiO3 水解生成具有特定形态的 SiO2 粒子 ,而在四聚赖氨酸寡肽 ( KKKK) 存在的条件下 ,Na2SiO3 快速水解 ,生成直径200 nm左右的 SiO2 粒子(图 5) 。这表明 ,对于聚赖氨酸 ,四聚体 ( KKKK) 是有效诱导 SiO2 纳米粒子生成的最小赖氨酸寡肽片段。赖氨酸是一种 Lewis 碱氨基酸 ,分子中起主要作用的是ε2NH3+ 阳离子基团 ,因此很容易吸引溶液中的 Si —O- 基团 ,导致硅酸的聚合。当聚赖氨酸的链长达到四聚以上时 ,聚赖氨酸这种聚电解质便很容易在溶液中通过静电作用等分子间作用力进行自组装 ,形成硅酸聚合所需的成核和模板位点 ,导致Si —O- 基团迅速聚合 ,从而有效地诱导 SiO2 纳米粒子的形成。这也是自然界中蛋白质等生物分子诱导硅沉积形成生物矿化硅的基本原理。人们利用 PCR技术解读了硅藻硅矿化蛋白 Silaffin 1A 的基因密码 ,其中赖氨酸2赖氨酸 ( KK) 残基具有很高的重复性 ,而且在赖氨酸的残基上发现很多氨基衍生物[36 ],并且 SiO2 的表面展示肽也含有最少为四聚的 RRRR或HHHH 片段。因此 ,四聚赖氨酸寡肽 ( KKKK) 也是一种 SiO2 的 motif 。
5 表面展示肽在无机纳米材料组装中的应用
生物分子与无机纳米材料的偶联是利用生物分子进行无机纳米材料组装的前提[37 —39 ] 。传统的偶联方式是先使用双功能基团一端与无机纳米材料直接作用(图 6) ,如金属材料的表面多通过巯基作用 ,氧化物表面多通过硅烷偶联 ,再将生物分子与功能分子的另一端相连接。这种方法虽然也取得了一些成果 ,但可偶联的材料种类存在一定的局限性。表面展示肽的特异性识别则对无机物没有限制 ,这样不仅增加了可选择的纳米材料的种类 ,而且同时赋予了纳米材料单元识别功能以及使组装的纳米网络结构具有可逆性和协同性等特性。
Sarikaya 等[22 ]利用识别 Au (111) 的表面展示肽GBP21 ,在金的表面上自组装形成了有序的单层膜。膜的厚度大约为 015 nm ,近似等于 GBP21β折叠的高度 ,膜中不同的结构域 (domain) 之间出现清晰的60°或者 120°的夹角 ,而 Au (111) 的晶面正好是六重对称 ,这进一步表明表面展示肽是通过分子识别机制在金的表面上进行自组装。在随后的工作中 ,Sarikaya 等[40 ] 又结合软 刻 蚀 技 术 ( soft2lithographictechnique) 利用表面展示肽组装了 Au 纳米粒子。首先 ,将 PDMS 印章浸润在多肽 GBP21 的 PBS 溶液中 ,使多肽 GBP21 吸附在 PDMS 印章上。然后将吸附有表面展示肽 GBP21 的 PDMS 印章 ,分别转印在化学图案化(MMAPA 的自组装膜) 和物理图案化(裸露的Au(111) ) 表面上。AFM 观察表明多肽 GBP21 在两种表面都形成了 PDMS 的印章图案(图 7) ,但裸露的Au 表面上的多肽结构要松散一些 ,说明通过识别机制的相互作用要弱于化学偶联。随后 ,将 Au 纳米粒子溶胶滴加在两种多肽图案上浸润一段时间 ,使Au 纳米粒子自组装到图案上。结果发现 ,在裸露的金表面上组装的纳米粒子的数量要明显地少于化学图案化的表面(图 8) 。这表明多肽 GBP21 与金的作用可能是受空间构象影响的 ,多肽 GBP21 与图案化的 Au (111) 面作用后没有更多的空间位置再与 Au纳米粒子作用 ;而在化学图案化 (MMAPA) 表面上 ,由于只是部分的氨基与 MMAPA 缩合成键 ,并没有破坏多肽 GBP21 的空间构象 ,因此 GBP21 仍可以与Au 纳米粒子发生相互作用。
从上面的例子可以看出 ,需要两段或多段展示肽的存在才能够实现两个纳米粒子或多个纳米粒子的同时组装。Belcher 等将 M13 噬菌体的 p Ⅷ蛋白和p Ⅲ蛋白分别修饰成两种表面展示肽 ,构建了 Au 纳米粒子的线性阵列以及 Au 和 CdSe 纳米粒子的异质纳米结构(图 9) 。这种有序的纳米粒子阵列可以作为模板合成具有良好导电特性纳米线 ,这种纳米线可以在纳米电子学器件中寻址和连接独立的纳米结构单元[41 ] 。
6 结束语
在过去的十几年里 ,利用 DNA、蛋白质、抗原和抗体等生物分子进行无机纳米材料的合成和组装已有很多报道。然而直接利用人工多肽分子进行无机纳米材料合成和组装的研究还相对较少 ,这主要是在目前的研究水平上多肽分子的结构和功能设计还比较困难。表面展示技术的出现 ,为筛选适用于无机纳米材料合成和组装的多肽提供了新的机遇。从筛选过程来看 ,表面展示肽是模拟生物矿化过程中多肽和无机物底物的特异性识别机制得到的一类多肽。这类多肽分子一方面可以诱导具有特殊结构与性质的纳米材料的合成 ,另一方面展示肽分子的引入为无机纳米材料的可控组装提供了新的机遇。
表面展示肽在无机纳米材料的合成与组装中的应用在过去几年里已经取得了一定的进展 ,未来的研究工作有以下一些问题还有待进一步解决 :
(1) 表面展示肽的筛选依赖于表面展示库的容量 ,只有表面展示库中存在的肽序才有可能被筛选到 ,但过大的展示库也将使筛选过程变得复杂。因此建立和选择更加合适的肽库是这一领域进一步发展的重要基础。
(2) 利用筛选得到的表面展示肽进行无机纳米材料的合成实验 ,研究生物分子和无机物的相互作用过程 ,虽然可以诱导合成一定结构和形貌的无机纳米材料 ,但进一步的结构和形貌调控很大程度依赖于相关机制的进一步澄清。例如 ,对于金属纳米材料的诱导合成 ,在不同展示肽浓度条件下可能会存在模板和催化两种作用相互协同竞争的机制。
(3) 利用表面展示肽进行无机纳米材料的组装 ,目前的研究结果还是简单的纳米结构的构建。但展示肽的修饰从原则上可以赋予组装的纳米结构以生物分子的识别性、协同性、可逆性、自修复等特性 ,双功能或多功能的多肽结构的设计与应用 ,可以实现两种或多种无机纳米材料所构成的复杂纳米结构的构建[9 ,10 ,42 ],为纳米器件的发展提供了新的途径。
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